结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析
作者：苏明权，岳乔红，周萍，段艳，杨柳，杨军兰，刘家云，郝晓柯
【关键词】 结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA
Preparation and antigenicity assay of recombinant proteins of Mycobacterium tuberculosis
【Abstract】 AIM: To clone and express the Mr 16×103 and Mr 38×103 proteins of Mycobacterium tuberculosis in E. coli， and to characterize its antigenicity and specificity. METHODS: The Mr 16×103 and Mr 38×103 antigen genes were amplified from Mycobacterium tuberculosis genome DNA by polymerase chain reactions and cloned into pGEX4T2 expression vector after sequencing. BL21 strain of E.coli was transformed with the recombinant vectors and induced to express recombinant proteins. The proteins were purified by affinity column chromatography. The antigenicity and specificity of purified proteins were estimated by enzymelinked immunoabsorbant assay. RESULTS: The BL21 strains of E. coli with recombinant vectors showed 42％ and 18% of Mr 16×103 （688 mg/L） and Mr 38×103 （217 mg/L） gene expressions after induction. The sensitivity of Mr 16×103 and Mr 38×103 proteins were 67.0％ and 79.8％, specificity were 100％ and 99％，accuracy were 84.0％ and 89.7％ respectively. CONCLUSION: The expressions and purifications of recombinant Mr 16×103 and Mr 38×103 antigens with good antigenicity and specificity facilitate their research and clinical application in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis.
【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis； antigen； gene expression； enzymelinked immunoabsorbant assay
【摘要】 目的：克隆表达结核分枝杆菌Mr 16×103和Mr 38×103重组蛋白，测定其抗原性和特异性. 方法： 利用聚合酶链反应自结核分枝杆菌基因组DNA扩增Mr 16×103和Mr 38×103抗原基因，经测序鉴定后克隆于pGEX4T2表达载体，转化于大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其抗原性与特异性. 结果：携带重组质粒的菌株经诱导产生的表达量分别为42％和18％；Mr 16×103和Mr 38×103蛋白量分别为：688 mg/L和217 mg/L. 其中Mr 16×103蛋白作为包被抗原ELISA法检测的灵敏度为67.0％, 特异性为100％, 准确性为84.0％；Mr 38×103蛋白作为包被抗原ELISA检测的灵敏度为79.8%,特异性为99%，准确性为89.7%. 结论：以Mr 16×103，Mr 38×103重组蛋白为抗原具有良好的抗原性和特异性，可用于结核分枝杆菌诊断方法的建立及临床诊断.
【关键词】 结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA
【中图号】 R378
0引言
结核病仍是目前危害全球人类健康的重要传染病，我国每年约有13万人因结核病而死亡. 对结核病的实验诊断主要依据细菌学检查和血清学检测，细菌学检查繁琐费时，培养周期长，达不到快速诊断的目的，血清学检测是一种方便快捷的实验室诊断方法，血清学检查的关键是结核分枝杆菌特异性抗原的提呈. 我们利用基因工程重组方法，通过大肠杆菌表达结核分枝杆菌的Mr 16×103和Mr 38×103蛋白，以Mr 16×103和Mr 38×103重组蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附试验测定两种抗原的反应性和特异性，以期证实其在血清学诊断中的价值.
1材料和方法
1.1材料结核分枝杆菌H37RV标准株（菌株号：ATCC27294）：购自卫生部国家菌种保存中心. E.coli DH5α，E.coli BL21由第四军医大学西京检验科保存；T4连接酶、限制性核酸内切酶BamHⅠ, EcoRⅠDNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Vitagene公司；GST亲和层析柱GSTrapFF购自Pharmacia公司；pGEX4T2表达载体购自Pharmacia公司.
1.2方法
1.2.1结核分枝杆菌Mr 16×103，Mr 38×103抗原基因的PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv培养物经煮沸灭活，蛋白酶K消化过夜，经酚. 氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA. 通过PCR扩增Mr 16×103，Mr 38×103基因. Mr 16×103抗原基因引物为： 5′AGGGGATCCATGGCCACCACCCTTCCCGTTCAG3′含BamH I酶切位点和起始密码子，5′TCAGCTCGAGCCCAGTGGTCAGTTGGTGGACCG3′含Xoh I酶切位点和终止密码子，预期扩增产物435 bp. Mr 38×103基因引物为：5′AGGGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATACGCT3′含BamH I酶切位点和起始密码子，5′GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG3′含Xoh I酶切位点和终止密码子，预期扩增产物1122 bp. PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min. 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果.
1.2.2基因的克隆与鉴定用胶回收试剂盒回收目的片段，将Mr 16×103，Mr 38×103抗原基因与质粒pGEX4T2同时用BamH I与Xoh I双酶切，T4连接酶连接，重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞. 利用Vitagene公司提供的小量质粒提取试剂提取质粒DNA，序列测定由上海生工生物工程公司完成.
1.2.3表达载体的构建将携带Mr 16×103，Mr 38×103抗原基因的重组质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收基因片段，Vitagene公司凝胶抽提试剂盒纯化，连接于双酶切的pGEX4T2表达载体，T4 DNA连接酶连接，转化于E.coli DH5α感受态细胞. 挑选单菌落，抽提质粒，酶切检测，并进行序列测定以证实插入序列是否正确. 挑选测序正确的重组表达载体质粒，再转化于BL21菌株.
1.2.4重组质粒的诱导表达及纯化将携带重组表达载体的BL21菌株接种于含氨苄青霉素0.1 g/L的LB培养基，37℃振荡培养过夜. 然后从中取1 mL接种于100 mL新鲜含氨苄青霉素的LB液体培养基， 37℃振荡培养3 h，加人诱导剂IPTG至终浓度0.1 mmol／L，37℃继续培养5 h. 离心收集菌体. 将诱导前后的样本各加入2×样品缓冲液100 μL，95℃沸水浴10 min，10 000 g离心10 min，取10 μL上清进行120 g/L SDSPAGE. 凝胶用考马斯亮蓝染色2 h，脱色3～5 h，观察目的蛋白，用CS9000薄层扫描仪在580 nm波长下对SDSPAGE蛋白电泳凝胶上的蛋白条带进行扫描，确定菌体总蛋白中目的蛋白比例. 用GSTrap FF蛋白纯化柱和凝血酶进行目的蛋白的纯化，按试剂盒说明书进行，得到纯化的重组结核杆菌Mr 16×103，Mr 38×103蛋白用SDSPAGE蛋白电泳进行检测.
1.2.5Mr 16×103，Mr 38×103重组蛋白抗原的ELISA检测对西安地区收集的94份血清样品进行ELISA检测，其中肺结核患者血清90份（经集菌涂片染色法或培养实验证实为结核分枝杆菌阳性），正常健康人血清100份为阴性对照. 将纯化Mr 16×103，Mr 38×103抗原溶液稀释于PBS溶液，37℃包被酶标板2 h. PBST溶液（PBS内含0.5 g/L Tween20）洗涤，再用封闭液（PBST内含1 g／L牛血清清蛋白)37℃封闭1 h，然后用PBST溶液洗涤. 加入1 μL血清样品，37℃温育1 h，PBST溶液洗涤. 加入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37℃温育30 min. 加入四甲基联苯胺显色液，室温显色30 min后终止反应. 450 nm检测吸光度值.
2结果
2.1目的基因的扩增与克隆用蛋白酶裂解法提取的结核杆菌基因组DNA用特异的引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，证实所得到的PCR产物为目的基因片断，与在GenBank中查到的结核分枝杆菌Mr 16×103，Mr 38×103蛋白的基因大小基本一致（图1）. 提取质粒，分别经双酶切后，得到435 bp和1122 bp的目的基因片段以及载体pGEX4T2的4950 bp片断，而空质粒对照只得到一条4970 bp左右的片段（图2）. 经测序证实目的基因的序列完全正确，未发生突变.
图1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳（略）
1,2: 空质粒pGEX4T2的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切结果; 3: DNA分子量标准; 4,5: 重组质粒pGEX16的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切结果; 6,7: 重组质粒pGEX38的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切结果.
图2重组质粒pGEX16和pGEX38的酶切鉴定（略）
2.2表达载体构建与重组蛋白诱导表达进一步测序表明， pGEX16及pGEX38中的插入序列及读码框架正确. 将测序正确的pGEX16， pGEX38和pGEX4T2分别转化感受态E.coli DH5α，在37℃用1.0 mmol/L IPTG诱导后，分别取菌株进行120 g/L SDSPAGE. 结果表明，pGEX16转化的菌株在Mr 42×103处出现一条新生蛋白条带，pGEX38在Mr 64×103处出现一条新生蛋白条带，均与预期结果一致；而pGEX4T2转化的菌株则只在Mr 26×103处有一新生条带，说明插入的Mr 16×103蛋白和Mr 38×103蛋白基因已经成功地在大肠杆菌中表达，并与GST形成了融合蛋白（图3，图4）. 对图3，图4中SDSPAGE凝胶上菌体蛋白条带分别进行凝胶薄层扫描分析，表达的融合蛋白GST16，GST38分别约占菌体总蛋白的42%和18%.
图3GST16融合蛋白的原核表达（略）
图4GST38融合蛋白的原核表达（略）
2.3重组蛋白的纯化经蛋白纯化后，经SDSPAGE蛋白电泳检测，可看到单一的纯化蛋白泳带（图5），紫外分光光度仪测量纯化蛋白的浓度：Mr 16×103，Mr 38×103蛋白分别为 688 mg/L和217 mg/L.
2.4二种抗原的ELISA检测根据棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度，以强阳性血清的A值为0.8左右，阴性血清的A值小于0.1的包被抗原稀释度作为工作浓度. 选择Mr 16×103蛋白的工作浓度为10 μg/L，Mr 38×103蛋白的工作浓度为1 μg/L. 以选择好工作浓度的蛋白抗原进行包被，分别检测病例组和对照组血清标本. 结果判断：以空白对照孔（只加蒸馏水200 μL）校零，在波长450 nm处读取各孔的A值，凡样品孔A值：阴性对照孔A值≥2.1，该样品即为阳性. 按检测结果各个抗原检测的灵敏度，即实际患病且被诊断试验诊断为患者的概率，则Mr 16×103蛋白抗原作为包被抗原ELISA法检测的灵敏度为67.0％（63/94），Mr 38×103蛋白抗原灵敏度为79.8％（75/94），再计算各个抗原检测的特异性，即实际未患病被诊断试验诊为非患者的概率，则Mr 16×103蛋白抗原的特异性为100％，Mr 38×103蛋白抗原的特异性为99.0％. 根据其各自的灵敏度和特异性计算其ELISA法检测的准确度，Mr 16×103蛋白抗原的准确度为84.0％，Mr 38×103蛋白准确度为89.7％.
图5纯化蛋白的SDSPAGE分析（略）
3讨论
结核菌抗体检测的关键是寻找有效的抗原成分. 目前发现的结核分枝杆菌特异性抗原最常用的是Mr 38×103抗原，另外有Mr 14×103，Mr 16×103抗原、ESAT6抗原与mtb8l抗原等［1-2］，上述几种抗原在结核杆菌抗体检测中的阳性率均各不相同［3-5］. 所以用基因重组技术制备结核分枝杆菌基因抗原，对结核病的诊断和方法学建立具有十分重要的意义.
Mr 16×103蛋白是一种小分子热休克蛋白，具有家族性的共同特征［6］. 研究发现MTB Mr 16×103蛋白抗原与结核病的长期潜伏有着密切的关系. 在培养条件下Mr 16×103蛋白从结核分枝杆菌生长对数期到稳定期具有很高的表达，在稳定期可成为优势生长蛋白，该蛋白在结核分枝杆菌感染宿主初期对于细菌的生长是必需的. Mr 16×103蛋白对结核分支杆菌的生存力和稳定性起着重要的调节作用，主要是因为它所含有的αcrystallin结构域是所有小分子热休克蛋白的同源序列，且高度保守. 因此在人体感染MTB潜伏期时Mr 16×103蛋白被认为有利于结核菌的存活，在85%的肺结核病人的血清中都可查到Mr 16×103蛋白［7］. TB Mr 38×103蛋白又叫抗原b（Pab），抗原5，抗原78，是MTB中主要的抗原，它是一种糖基化的脂蛋白. Andensen等从λgt11 MTB DNA基因文库中分离出编码Mr 38×103蛋白的基因，该基因序列含1122个碱基对，Mr 38.2×103. Mr 38×103蛋白的氨基酸序列与大肠杆菌的磷酸盐结合蛋白(PstS)有30％的同源性，PstS是大肠杆菌磷转运系统中的磷结合蛋白，当磷缺乏时PstS可被激活. 其后Andersen证实Mr 38×103蛋白果然也与磷代谢有关，因在磷饥饿培养条件下，该蛋白被大量诱导［8］. MTB Mr 38×103蛋白是MTB中主要的抗原，它是一种糖基化的脂蛋白，是MTB特异性抗原，有两个B细胞抗原决定簇.
我们根据结核分枝杆菌的生长特性，以Mr 16×103，Mr 38×103蛋白进行基因工程表达，在大肠杆菌中成功表达了结核杆菌两种基因重组蛋白，为研究其活性和建立以Mr 16×103和Mr 38×103基因抗原为目标的血清学检测方法提供条件. 以Mr 16×103蛋白为抗原，经ELISA方法检测临床样品中的结核杆菌抗体灵敏度为：67.0%，特异性为：100%，准确性为：84.0%；以Mr 38×103蛋白为抗原，经ELISA方法检测临床样品中的结核杆菌抗体灵敏度为：79.8%， 特异性为： 99.0%， 准确性为： 89.7%. 实验结果证实，以两种基因重组蛋白为抗原建立结核分枝杆菌血清学检测方法，在结核病诊断上有一定的使用价值，为临床诊断结核病提供切实可行的手段.
【】
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