大鼠急性一氧化碳中毒后迟发性脑病模型的建立

          作者：赵天智，常耀明，李金声，谢小萍

【关键词】  Morris水迷宫；一氧化碳中毒；迟发性脑病；大鼠

　　Establishment of delayed neuropsychologic sequelae rat model after acute carbon monoxide poisoning

　　【Abstract】 AIM: To establish the delayed neuropsychologic sequelae rat model after acute carbon monoxide (CO) poisoning for further elucidating its pathogenesis. METHODS: Male SD rats (240-280 g BW) were poisoned with CO in the animal experimental hyperbaric oxygen chamber. Cognitive ability was measured by the escape latency of searching the objective in the Morris water maze. The brains of the rats (3, 7, 10, 20 d after poisoning) were taken for paraffin pathological section and HE staining to observe the pathological change in cerebral cortex and hippocampal area. RESULTS: Rats lost consciousness when they were exposed to 2000 ppm (part per million) CO for 40 min and then 3000 ppm for up to 20 min. Maze test showed that the escape latency of the CO poisoned rats was significantly longer than the air exposed rats (F=4.74，P=0.047). The pathological examination revealed apparent neuronal degeneration and necrosis in the cerebral cortex and hippocampal area in CO poisoned rats. CONCLUSION: Besides the evidence of pathologic results, our models basically simulate the praxiologic change induced by central nervous system damage in the patients with delayed neuropsychologic sequelae after CO poisoning.

　　【Keywords】 Morris water maze;  carbon monoxide poisoning; delayed neuropsychologic sequelae; rats

　　【摘要】 目的: 建立大鼠急性一氧化碳（CO）中毒致迟发性脑病模型，以探讨其发病机制. 方法: 质量240~280 g雄性SD大鼠，于动物实验高压氧舱内行急性CO暴露，以Morris水迷宫中搜索目标的逃避潜伏期(escape latency)来评价大鼠的认知记忆能力，并于染毒后3，7，10，20 d取脑组织，常规制备石蜡病理切片，行HE染色观察急性CO中毒后大鼠脑皮质及海马神经元的病理性改变. 结果:大鼠在2000×10-6体积分数CO浓度和3000×10-6体积分数CO浓度下分别暴露40 min和20 min后全部昏迷，Morris水迷宫测试发现CO暴露组大鼠逃避潜伏期显著落后于空气对照组（F=4.74，P=0.047），病检查发现CO暴露组大鼠的皮质及海马有明显的神经元变性坏死. 结论: 本实验建立的模型基本模拟了CO中毒后迟发性脑病患者中枢神经系统损伤的行为学特征改变，且有相应的病理学检测结果作为其佐证.

　　【关键词】 Morris水迷宫；一氧化碳中毒；迟发性脑病；大鼠

　　【中图号】 R595.1

　　0引言

　　一氧化碳（carbon monoxide, CO）中毒后3%~30%的患者经过一段时间的“假愈期”会出现以痴呆、精神症状和锥体外系症状为主迟发性脑病(delayed neuropsychologic sequelae, DNS)［1］. 目前其发病机制仍未完全阐明，缺少可靠的动物模型是阻碍其深入研究的重要原因之一［2］，主要问题在于中毒浓度的掌握和动物行为学评价方法的缺陷上. 因此，我们尝试采用急性静态CO吸入的方法制备大鼠的DNS动物模型，并采用Morris水迷宫来评价中毒后大鼠认知记忆能力的改变，为进一步研究DNS的发病机制提供客观有效的手段.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1CO气体于染毒前新鲜制备.

　　1.1.2染毒装置DWC4501150型（上海七零一所）动物实验高压氧舱，舱体为直径0.45 m，长1 m的圆筒形，有效空间160 L，可同时对4只大鼠染毒.

　　1.1.3行为实验装置由Morris水迷宫和图像自动监视系统(Morris Maze Experimental Assistant System, MMEAS)组成（第四军医大学防原教研室提供）. Morris水迷宫为内壁黑色的不锈钢圆柱形储水池(d=100 cm，h=50 cm)，内置一个高度可调位置可移动的黑色圆台，圆台顶部直径为10 cm. 在水池上缘等距离设置东南西北四个标记点，以这四个入水点在水面和水桶底部的投影点，将水面和水池均分为四个象限，圆台设置于某一象限中间. 实验时，使水深淹没圆台顶部2 cm，调节水温至22～24℃之间. 整个实验周期之内室内物品摆设和实验人员站立位置相对固定，并严格控制噪声干扰. MMEAS系统以图像采集卡、摄像机、图像监视器等为主要扩展硬件，利用图像软件包提供的各层次库函数完成数据采集和统计处理.

　　1.1.4实验动物封闭群健康成年雄性SpragueDawley大鼠（第四军医大学实验动物中心提供），约9～10 wk龄，体质量为240～280 g. 饲养于12 h明暗交替，室温18~23℃环境，喂饲标准大鼠饲料，不限食水.

　　1.2方法

　　1.2.1染毒方法参照Thom等［ 3］报道的染毒方法及预实验的结果，将清醒大鼠置于动物实验高压氧舱内（每次最多4只）密封舱门，由进气口加入制备的纯净CO气体，使舱内CO气体浓度达到2000×10-6体积分数，维持40 min，后补加气体达3000×10-6体积分数，约20 min，至大鼠出现昏迷时止.

　　1.2.2Morris水迷宫行为测试16只雄性SD大鼠适应性饲养1 wk后，随机分为CO暴露组和空气对照组，每组8只. 大鼠于CO暴露后的第二日上午10点开始行水迷宫实验，实验时从除站台外的三个象限随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，每一次入水位置是假性随机的. 观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)，如果大鼠在120 s内未找到平台，则人为引导大鼠到达平台且停留30 s，这时逃避潜伏期为120 s. 实验每隔一日进行一次，持续到染毒后21 d，每次实验训练3次，每个象限一次，每次间隔20 min，3次成绩的平均值记为当天成绩.

　　1.2.3病理学检查28只雄性SD大鼠适应性饲养1 wk后，随机分为A，B，C，D，E 5组，其中A，B，C，D 4组为实验组，每组5只，E组8只为空气对照组. 实验组按上述染毒方法予以染毒，对照组按相同步骤注入空气. A，B，C，D 4组分别于染毒后3，7，10，20 d取脑，实验组取脑同时取2只E组大鼠作为对照. 大鼠用20 g/L戊巴比妥钠(60 mg/kg) 腹腔麻醉，开胸暴露心脏，插管，由左心室经主动脉快速灌注生理盐水200 mL, 40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PB液400 mL，断头取脑，再置于多聚甲醛PB液中浸泡24 h，根据大鼠脑定位图谱选取冠状切面（Bregma4.16 mm）海马与齿状回互包平面，按常规脱水、媒染、浸蜡步骤，将组织块包埋制成蜡块，石蜡切片机连续切取厚5 μm的切片，行HE染色.

　　统计学处理: 数据以x±s表示，采用SPSS 10.0软件进行重复测量资料方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1大鼠染毒表现2000×10-6体积分数CO气体浓度下，前15 min大鼠表现活跃，有轻度的兴奋和躁动，随后的25~40 min，大鼠呼吸急促，呼吸幅度明显增大，口鼻粘膜及耳、爪、尾皮肤成樱桃红色，补加气体浓度至3000×10-6体积分数时，大鼠出现躁狂，随后四肢瘫软无力，至60 min时大鼠全部昏迷，出舱后吸入空气直至意识恢复.

　　2.2Morris水迷宫测试两组大鼠爬上平台的逃避潜伏期均随学习组次的增加而缩短. 经重复测量资料方差分析，CO暴露组大鼠逃避潜伏期落后于空气对照组（F=4.74，P=0.047, 表1）.

　　表1两组大鼠平均逃避潜伏期（略）

　　2.3HE染色正常对照组大鼠脑内神经元呈圆形或椭圆形，细胞形态正常，核膜完整，核仁清晰可见，细胞核呈淡蓝色（图1A，B）. CO中毒组大鼠脑内有广泛的病理改变，皮质、海马、以及齿状回出现大量的神经元变性坏死. 皮质中以顶叶及颞叶皮质损伤最为严重，可见点片状坏死，坏死神经元呈三角形或多角形，细胞缩小，细胞核固缩，核仁不明显，周围出现空晕，在变性坏死的神经元周围可见胶质细胞浸润（图2A）；海马锥体细胞层变薄，两侧细胞稀疏，CA1区和CA4区坏死明显（图2B）. 以上病理改变在4组脑切片中均可观察到，以B组、C组最为明显. D组大鼠脑切片中还可以见到坏死神经元被吸收后所留下的龛影（图2C），其周亦可见到胶质细胞的踪迹.

　　3讨论

　　日常生活中的CO中毒，主要是经由呼吸道吸入引起，因此，CO中毒模型多采用吸入染毒法制备，一般可分为动式和静式两种. 动式吸入染毒有浓度较稳定、可避免缺氧及二氧化碳蓄积等优点，但该法所需仪器昂贵，CO消耗量巨大，难以普遍应用. 我们采用静式吸入法对大鼠进行染毒来制备DNS模型，CO的使用量不多，实验室即可自行配置，且染毒舱体的体积较大可有效避免长时间染毒过程中氧分压降低，二氧化碳分压上升所导致缺氧对实验结果产生的影响，并可同时对多只大鼠染毒.

　　图1对照组大鼠组织结构HE ×400（略）

　　图2大鼠组织结构改变HE ×400（略）

　　CO中毒后DNS患者的中枢神经系统主要表现出痴呆、记忆力受损、定向力障碍等症状［1］. 而经典的Morris水迷宫所检测的是大鼠在多次的训练中，学会寻找固定位置的隐蔽平台，形成稳定的空间位置认知的能力. 从信息的加工和提取方式来看，这种空间记忆应该属于陈述性记忆. 而临床健忘和痴呆的患者，正是陈述性记忆首先受损而且比较突出. 与过去的跳台、避暗等检测工具相比，Morris水迷宫主要优点在于:能系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平；将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，而且对动物的伤害性刺激作用较小，减少了对学习记忆过程检测的干扰［4］. 所以，我们选取Morris水迷宫作为CO中毒后DNS大鼠模型的行为学评价方法. 在Morris水迷宫测试中发现，CO暴露组大鼠的逃避潜伏期落后于空气对照组（F=4.74，P=0.047），提示CO暴露组大鼠出现了认知记忆功能的障碍.

　　海马区与大脑学习记忆功能密切相关，其损伤会对这一功能产生严重影响，而DNS患者临床表现正是以痴呆、记忆力受损等神经功能紊乱症状为主，提示海马区神经细胞的迟发性坏死可能是DNS发病的病理基础. 我们复制的大鼠模型的中枢神经系统病检查显示:CO暴露后3 d，大鼠脑皮质和海马区细胞出现变性和坏死，至7~10 d时最为严重，并至少持续到20 d，与Morris水迷宫行为学检测提示中枢神经系统出现损伤的结果相符合. 临床上DNS患者的影像学表现亦与本研究结果相符，如张镭［5］报道在CT检查中，海马回病变是CO中毒迟发脑病和急性CO中毒的特异表现；MRI上亦可显示皮层和海马区出现异常高信号等［6］.
综上所述，本实验建立的模型基本模拟了CO中毒后DNS患者中枢神经系统损伤的行为学特征改变，且有病理学检测的结果为这种改变提供了佐证.

　　【参考】

　　［1］ Piantadosi CA. Carbon monoxide poisoning ［J］. Undersea Hyperb Med, 2004, 31:167-177.

　　［2］ Raub JA, Mathieu NF, Hampson NB, et al. Carbon monoxide poisoning-a public health perspective ［J］. Toxicology, 2000, 145(1):1-14.

　　［3］ Thom SR, Bhopale VM, Fisher D, et al. Delayed neuropathology after carbon monoxide poisoning is innunemediated ［J］. Proc Nat Acad Sci USA, 2004, 101:13660-13665.

　　［4］ 胡镜清, 温泽淮, 赖世隆. Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探 ［J］.广州中医药大学学报, 2004,17(2): 117-119.

　　［5］ 张镭. 一氧化碳中毒后迟发性脑病的CT特性 ［J］.临床医学影像杂志, 1998, 9: 93-96.

　　［6］ ODonnell P, Buxton PJ, Pitkin A, et al. The magnetic resonance imaging appearances of the brain in acute carbon monoxide poisoning ［J］. Clin Radiol, 2000, 55(4): 273-80.