MAPK在葡萄糖及AngⅡ致血管平滑肌细胞增殖反应中的作用
【关键词】 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)；细胞外信号调节MAP激酶类(ERKs)；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)；高糖；肌,平滑,血管/细胞学；增殖反应
Regulation of MAPK in glucose/angiotensin Ⅱinduced proliferation of vascular smooth muscle cells
【Abstract】 AIM: To study the role of mitogen activated protein kinase(MAPK) in glucose（GS）/angiotensin Ⅱ(AngⅡ)induced proliferation of rat vascular smooth muscle cell (VSMC). METHODS: The protein sythesis rate and protein content were used as the indexes of VSMC proliferation in our study.The DNA synthesis rate was quantified by ［3H］thymidine incorporation. The protein synthesis rate was quantified by ［3H］leucine incorporation. Regulation of extracellular signal regulated kinase(ERKs) in Ang Ⅱinduced proliferation were investigated by preincubation with either PD098059 or/and high glucose (HG). RESULTS: AngⅡ(10-7 mmol/L) significantly increased ［3H］thymidine incorporation and ［3H］ leucine incorporation and HG (10-3 mmol/L) significantly increased ［3H］thymidine incorporation and ［3H］ leucine incorporation, and AngⅡ+HG exerted a more significant effect. Preincubation of VSMC with PD098059 significantly inhibited the increase of ［3H］thymidine incorporation induced by AngⅡand very significantly inhibited the increase of ［3H］ thymidine incorporation induced by AngⅡ+HG. Preincubation of VSMC with PD098059 partly inhibited the increase of ［3H］ leucine incorporation induced by AngⅡand significantly inhibited the increase of ［3H］leucine incorporation induced by AngⅡ+HG. CONCLUSION: The activation of MAPK plays an important role in VSMC growth and proliferation reaction induced by GS/AngⅡ.
【Keywords】 mitogenactivated protein kinase (MAPK) ; extracellular signal regulated MAP MAP kinases angiotensinⅡ(AngⅡ) ; high glucose(HG); muscle, smooth, vascular/cytology; proliferative response
【摘要】 目的： 研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在葡萄糖（GS）和/或血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导大鼠动脉平滑肌细胞促增殖中的作用及其可能的调控机制. 方法： 实验以平滑肌细胞蛋白合成速率和蛋白含量为平滑肌细胞增殖的指标，以平滑肌细胞3Ｈ亮氨酸掺入率表示细胞蛋白质合成速率，通过3H胸苷(3HTdR)反映平滑肌细胞DNA的代谢及细胞增殖情况；并通过给予PD098059及高浓度葡萄糖(HG)预处理，观察它们对细胞蛋白合成、DNA代谢及细胞增殖的影响. 结果： ① AngⅡ(10-7 mol/L)处理平滑肌细胞，3Ｈ胸苷掺入率明显增高；HG (25×10-3 mol/L)处理平滑肌细胞，3Ｈ胸苷掺入率明显增高；AngⅡ＋HG处理平滑肌细胞3Ｈ胸苷掺入率显著增高. ② AngⅡ增加3Ｈ胸苷掺入的作用可明显被PD098059所抑制；AngⅡ＋HG增高3Ｈ胸苷掺入的作用也可被PD098059所抑制. ③ AngⅡ(10-7 mol/L)处理平滑肌细胞，3Ｈ亮氨酸掺入率明显增高；HG (25×10-3 mol/L)处理平滑肌细胞，3Ｈ亮氨酸掺入率增加；AngⅡ＋HG处理平滑肌细胞3Ｈ亮氨酸掺入率显著增加. ④ AngⅡ增加3Ｈ亮氨酸掺入的作用可部分被PD098059所抑制；AngⅡ＋HG增加3Ｈ亮氨酸掺入的作用可显著被PD098059所抑制. 结论： 应用MAPK的特异性抑制剂PD098059抑制血管平滑肌细胞的增殖，证明MAPK激活在GS和/或AngⅡ导致平滑肌细胞增殖反应中有重要作用.
【关键词】 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)；细胞外信号调节MAP激酶类(ERKs)；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)；高糖；肌，平滑，血管/细胞学；增殖反应
0引言
引起高血压及动脉粥样硬化的发病机制十分复杂，其中主要的病理改变之一就是血管滑肌细胞增生、肥大，继而造成血管壁弹性下降、管腔变窄. 已证实高葡萄糖及血管紧张素Ⅱ均对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖及DNA合成有促进作用，引起VSMC增殖是PKC途径，并与MAPK信号途径的激活有关［1-3］. 本研究通过应用MAPK信号转导途径的特异性阻滞剂PD098059对体外培养的SD大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖的影响，进一步探讨MAPK信号途径在心血管疾病中的作用机制，为心血管疾病防治提供依据.
1材料和方法
1.1材料SD大鼠由等二军医大学实验动物中心提供；ＰD098059和血管紧张素Ⅱ购自Sigma公司；3Ｈ胸苷、3Ｈ亮氨酸、小牛血清、高浓度葡萄糖、DMEM培养基及其他实验用品由长海中心实验室提供．［3H］液闪计数检测由长海医院中心实验室完成.
1.2SD大鼠颈动脉血管平滑肌细胞培养选用6周龄230 g SD大鼠1只，按［4］的方法分离颈动脉平滑肌组织，贴壁法原代细胞培养和传代细胞培养VSMC，细胞鉴定后于第4 wk开始传代，第6~8代的细胞用于实验.
1.33Ｈ胸苷掺入法测定VSMC的DNA合成量按参考文献［4］的方法改进. 制备4×108 cell/L悬液分别接种于24孔培养板，孵育24 h贴壁后换无血清DMEM培养液24 h，每孔分别加入PD098059(5×10-5 mol/L)预处理30~45 min，给予HG(25×10-3 mol/L)和/或AngⅡ(10-7 mol/L)孵育30 min后，每孔加入 3Ｈ胸苷孵育12 h，弃去培养基，PBS冲洗两次，给予胰蛋白酶消化，加入冷PBS液终止反应为细胞悬液，用自动细胞收集仪经微孔滤膜收集细胞，滤膜烘干后置闪烁瓶中，加入闪烁液后，在闪烁计数仪上测定［3H］的放谢性强度，结果以cpm表示. HG和/或AngⅡ组给予相应的双蒸水预处理，其他均与处理组相同；对照组在预处理及给予AngⅡ时均为双蒸水，其他与处理组相同. （每组3个样本，2 wk后重复实验1次，各组n=6）.
1.43Ｈ亮氨酸掺入法测定细胞蛋白合成代谢实验方法及各种处理同1.3，只是用3Ｈ亮氨酸代替3Ｈ胸苷.
统计学方法: 结果以x±s表示,统计学用χ2 检验，P<0.05表示差异有显著性意义.
2结果
2.1GS和/或 AngⅡ对SD大鼠颈动脉VSMC的DNA合成速率的影响在无血清培养液中，AngⅡ剂量依赖性增加SD大鼠VSMC的3Ｈ胸苷掺入；GS浓度依赖性增加SD大鼠VSMC的3Ｈ胸苷掺入. 以10-7 mol/L作为AngⅡ的标准实验浓度；以25×10-3 mol/L作为GS的标准实验浓度. AngⅡ处理VSMC可使3Ｈ胸苷掺入明显增加（增加183.0%），该作用可被PD098059明显抑制（PD098059预处理组比AngⅡ处理组降低35.0%,增加被抑制52.3%,表1）. HG处理可使3Ｈ胸苷掺入明显增加（增加53.0%）；HG+ AngⅡ处理可使3Ｈ胸苷掺入显著增加（增加239.0%），该作用可被PD098059显著抑制（PD098059预处理组比HG+AngⅡ处理组降低55.0%,抑制79.0%,表1）.
2.2GS和/或 AngⅡ对SD大鼠颈动脉VSMC的蛋白质合成速率的影响在无血清培养液中，AngⅡ剂量依赖性增加SD大鼠VSMC的3Ｈ亮氨酸掺入；GS浓度依赖性增加SD大鼠VSMC的3Ｈ亮氨酸掺入. 以10-7 mol/L作为AngⅡ的标准实验浓度；以25×10-3 mol/L作为HG的标准实验浓度. AngⅡ处理VSMC可使3Ｈ亮氨酸掺入明显增加（增加74.7%），该作用可被MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059部分抑制（PD098059预处理组比AngⅡ处理组降低11.0%,抑制29.3%,表1）. HG处理可使3Ｈ亮氨酸掺入增加（增加15.0%）；HG+ AngⅡ处理可使3Ｈ亮氨酸掺入明显增加（增加85.0%），该作用可被PD098059显著抑制（PD098059预处理组比HG+AngⅡ处理组降低38.0%,抑制86.0%,表1）.
表1GS 和/或AngⅡ及PD098059对VSMC 3H胸苷掺入率和3H亮氨酸掺入率的影响（略）
bP<0.01, aP<0.05 vs正常对照.
3讨论
高血压的血管重构、弹性功能降低与血管平滑肌细胞（VSMC）增生、肥大密切相关［1］. AngⅡ作为一种重要的致血管收缩因子，具有促进血管平滑肌细胞增殖、肥大的作用，在高血压、动脉粥样硬化等病理生理过程中起重要作用；高浓度葡萄糖可以促进血管平滑肌细胞增殖、肥大的作用；并证实MAPK信号转导途径的逐级激活可能是血管平滑肌细胞增殖、肥大的重要机制［2-3，5］. 另外，ACEI等的改善动脉粥样硬化及血管弹性功能的机制与AngⅡ水平变化及MAPK信号转导途径均相关［6］.
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是与细胞增殖关系最为密切的细胞内信号转导蛋白激酶，是细胞外信号与细胞核之间信息转导的共同通路. 在哺乳动物的细胞中并行存在3条MAPK信号转导通路，其中ERK信号途径被认为是经典的MAPK信号转导途径［1-3］. 与高血糖、AngⅡ促进血管平滑肌细胞增殖、肥大的作用主要相关的也是ERKs途径. MAPK在细胞信号转导方面有二大特征： ① 活化的MAPK通过转位方式进入细胞核，激活其下游底物，主要是一些编码核转录因子的早反应基因（如原癌基因, cfos, cmyc, cjun和Eng1等）表达，调控细胞生长反应，导致次级反应基因（如ANF基因、MHC基因、MLC2基因等）的异常表达，影响细胞功能；② MAPK可将多个不同受体系统（如G蛋白耦联受体和蛋白酪氨酸激酶受体）介导的信号加以整合，起着多种信号的交汇点或共同通路的作用. 但激活的MAPK很快被细胞内磷酸酶去磷酸化而失活，因此MAPK活性受其上游MAPK激酶及其下游MAPK磷酸酶的双重调控. 只有磷酸化的MAPK才具有活性，因而可通过检测胞浆内及核中的磷酸化MAPK的含量来测定MAPK的活性，并通过分析相关的因素对磷酸化MAPK的效应来分析MAPK可能的作用机制［7-10］.
我们以平滑肌细胞蛋白合成速率和蛋白含量为平滑肌细胞增殖的指标，平滑肌细胞3Ｈ亮氨酸掺入率表示细胞蛋白质合成代谢速率，通过3Ｈ胸苷(3ＨTdR)反映平滑肌细胞DNA的代谢及细胞增殖情况；并通过给予MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059预处理,观察其对细胞蛋白合成和DNA的代谢及细胞增殖的影响. 结果显示给予HG和/或AngⅡ后VSMC的DNA合成显著增加，而这种增加效应可被PD098059阻滞，说明AngⅡ影响VSMC的细胞增殖、生长、肥大的效应可能是通过激活MAPK信号转导途径而促进DNA的合成；结果又显示给予HG和/或AngⅡ后VSMC的蛋白质合成显著增加，而这种增加效应可被PD098059明显阻滞，说明AngⅡ影响VSMC的细胞增殖、生长、肥大的效应可能是通过激活MAPK信号转导途径而促进蛋白质的合成. 另外，HG+ AngⅡ组增加蛋白合成和DNA的代谢明显，且该作用可被PD098059非常显著抑制. 因此认为AngⅡ促进VSMC细胞增殖、肥大的效应，可能是通过激活MAPK信号转导途径来完成的，而且与胞浆和胞核的MAPK信号转导途径均相关，这与国外的研究相符合. 但本研究中提示在与胞浆和胞核的MAPK信号转导途径均相关，MAPK系统对DNA合成效应的影响明显大于对蛋白质合成的影响. 因此认为GS及AngⅡ促进血管平滑肌细胞增殖、肥大的作用中，MAPK系统对DNA合成效应的调节是重要的机制之一. 从而认为糖尿病者AngⅡ促进血管平滑肌细胞增殖、肥大的作用更值得重视.
综上所述，MAPK激活在AngⅡ导致平滑肌细胞增殖反应中具有重要作用,并可通过MAPK信号途径的特异性抑制剂的抑制效应影响血管平滑肌细胞的增殖；而且HG及AngⅡ促进血管平滑肌细胞增殖、肥大的作用中，MAPK系统对DNA合成效应的调节更为重要. 相关的MAPK信号途径确切的调节机制有待于进一步研究.
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