反义寡核苷酸对视网膜色素上皮细胞中端粒酶逆转录酶表达及细胞增殖的作用

【关键词】  视网膜色素上皮；,寡核苷酸类,,反义；,端粒酶逆转录酶

　　Effect of antisense oligonucleotides on telomerase reverse transcriptase gene expression and retinal pigment epithelium cell proliferation　　

          【Abstract】 AIM: To investigate the telomerase reverse transcriptase (TERT) gene expression in retinal pigment epithelium (RPE) cells and the inhibitory effect of antisense oligonucleotides (ASODN) encoding TERT mRNA to gene expression and proliferation of RPE cells, so as to search for a new genetic therapy for proliferative vitreoretinopathy (PVR). METHODS: (1) Rabbit RPE cells cultured in vitro were detected for TERT expression by streptavidinbiotin complex (SABC) immunohistochemistry at several time points. (2) The ASODN and sense oligodeoxynucleotides (SODN) encoding TERT were delivered to the RPE cells at different concentrations, and then TERT expression was detected by immunohistochemistry. (3) Exposed to different concentrations of ASODN and SODN, proliferation activity and growthinhibitory rate of RPE cells were measured by MTT methods. RESULTS: TERT expression was markedly suppressed in the RPE cells treated with 5 and 10 μmol/L TERT ASODN. TERT ASODN significantly inhibited proliferative activity of RPE cells in a dosedependent manner. CONCLUSION: ASODN complementary to TERT mRNA at some concentration can sequencespecifically suppress TERT expression in RPE cells and cellular proliferative activity, and show a potential application in further experimental study for PVR genetic medication.

　　【Keywords】 retinal pigment epithelium; oligonucleotides, antisense; telomerase reverse transcriptase

　　【摘要】 目的：研究视网膜色素上皮(RPE)细胞中端粒酶逆转录酶(TERT)的表达及其反义寡核苷酸(ASODN)对其表达和细胞增生的抑制作用，为增生性玻璃体视网膜病变(PVR)探索基因新途径. 方法：体外培养兔眼RPE细胞，在不同时间采用链霉亲合素生物素化过氧化物酶复合物(SABC)免疫组织化学法检测TERT的表达；不同浓度的TERT ASODN和正义寡核苷酸(SODN)分别作用于体外培养的RPE细胞，采用免疫组织化学方法检测TERT的表达；四唑盐比色法(MTT)检测在不同浓度的TERT ASODN和SODN作用下RPE细胞生长活性及其生长抑制率. 结果：体外培养兔眼RPE细胞可表达TERT，在5，10 μmol/L ASODN作用下，TERT的表达明显受抑制；TERT ASODN能明显抑制RPE细胞增生活性，并呈剂量依赖性. 结论：一定浓度TERT ASODN能序列特异性地抑制RPE细胞TERT表达和增生活性，有望进一步用于PVR的治疗实验研究.

　　【关键词】 视网膜色素上皮； 寡核苷酸类， 反义； 端粒酶逆转录酶

　　【中图号】 R322.91

　　0引言

　　端粒（telomere）是染色体末端高度保守的重复核苷酸序列，随着细胞的分裂而逐渐缩短，细胞趋向衰亡. 端粒酶是维持染色体长度和功能的重要物质，端粒酶的激活可使细胞持续增殖，避免衰老死亡. 在增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinapathy,PVR）的病理过程中，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）细胞充当了极其重要的角色. 因此抑制RPE细胞的增生成为防治PVR的重要途径. Dickson等［1］提到端粒酶失活，端粒不断缩短可能是RPE细胞衰老的原因. 而增生细胞普遍存在端粒酶RNA结构，它可反向合成TTAGGG，加在DNA末端，从而使细胞的分裂不断进行下去［2］. 而抑制端粒酶就能够抑制细胞的这种分裂作用，从而抑制细胞增生. Riches等［3］曾报道：用端粒酶处理可获得永生的人视网膜色素上皮系（340RPET53）. 如何通过影响端粒酶活性抑制RPE细胞增生是目前研究的热点.

　　端粒酶逆转录酶（telomerase　reverse transcriptase，TERT）作为端粒酶蛋白主要组分，被称为端粒酶活性作用的限速因子［4］. 端粒酶通常在除永生细胞系外的正常组织无活性表达，而TERT则可在正常组织中表达［5］. 鉴于TERT在细胞增生过程中的重要作用，我们利用反义核苷酸技术，通过封闭TERT基因表达而抑制RPE细胞增生，探索PVR基因治疗的新途径.

　　1材料和方法

　　1.1兔眼RPE细胞的培养摘取健康灰色家兔眼球，按常规酶消化法眼杯内收获RPE细胞，加入含200 mL/L新生牛血清的改良Eagle培养液(Dubleccos modified Eagle medium, DMEM)，吹打制成细胞悬液；最后以细胞密度5×104/mL接种于培养瓶中，置37℃，饱和湿度、50 mL/L CO2的培养箱中培养和传代. 取第3代的培养细胞,用博士德公司试剂盒作角蛋白免疫组织化学检测.

　　1.2TERT免疫化学检测RPE细胞取第5代的RPE细胞,以细胞数为5×104个/mL的密度接种于置有玻片的24孔板(500 μL/孔). 37℃，50 mL/L CO2条件下，在含200 mL/L新生牛血清的培养液培养24，48，72 h后，取出长有细胞的玻片用SABC法作TERT免疫组织化学检测：一抗为TERT小鼠抗人(兔、鼠)单克隆抗体(Boster产品)，滴度1∶100，二抗为羊抗鼠生物素化二抗(1∶100).

　　1.3制备寡核苷酸(oligodeoxyribonucletide,ODN)备用原液采用与以TERT mRNA翻译启始密码子为起点的一段序列，与该序列互补的为ASODN，与该序列相同的为SODN,序列分别为：5′GAGCGCGGGTCATTGTGCT3′ (ASODN)，5′AGCACAATGACCCGCGCTC3′(SODN). 由上海百沃斯生物公司采用DNA生物合成仪合成，全硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后冻干粉保存. 临用前再加入DMEM液，稀释成2.5，5和10 μmol/L使用.

　　1.4检测ODN作用下RPE细胞TERT表达取第5代的RPE细胞，以细胞数5×104/mL密度接种于置有玻片的24孔板(500 μL/孔)，常规培养24 h后，吸弃含血清培养液，每孔分别加入500 μL的含有上述3种浓度的ASODN和SODN的DMEM液，及无ODN混合液的空白对照DMEM液. 在37℃, 50 mL/L CO2条件下孵育12 h后加入含200 mL/L新生牛血清的培养液500 μL/孔，继续培养12 h，取出长有细胞的玻片按前述SABC法作TERT免疫组织化学检测. 结果采用盲法计数，细胞核内呈棕黄染色为阳性标志. 每张培养玻片随机选取四周及中央视野，在显微镜下计数阳性细胞率，其平均值即代表TERT阳性表达率.

　　1.5RPE细胞活性检测MTT试验进行RPE细胞的活性检测. 取第5代RPE细胞，以细胞数为1×105个/mL密度的细胞悬液接种96孔板，100 μL/孔. 常规培养24 h后换以含上述3种浓度(每一浓度6个平行孔)的ASODN和SODN混合液DMEM液，100 μL/孔，分别作为反义组和正义对照组，并各设空白对照. 在37℃, 50 mL/L CO2条件下孵育12 h后，每孔加入含200 mL/L新生牛血清的培养液100 μL继续培养12 h，然后每孔吸出上清液100 μL再加5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h后，弃去上清液，加入二甲亚砜150 μL，振摇15 min，于酶标仪550 nm波长下测吸光度(A).

　　统计学处理： 数据以x±s表示. 采用SPSS 11.0软件进行统计分析，所用的统计分析方法为方差分析，多重比较采用LSDt检验.

　　2结果

　　2.1兔RPE细胞培养与免疫组织化学鉴定原代培养的RPE细胞多呈扁型或多角形，细胞浆内富含棕褐色颗粒，传代后色素颗粒消失，细胞形态转为梭形. 角蛋白阳性细胞细胞浆呈棕黄色着色，阳性率几乎达100%.

　　2.2RPE细胞TERT表达TERT免疫组织化学检测显示阳性表达细胞细胞核呈斑块状或点状染色，其中部分染色较淡呈弱阳性表达（图1）.

　　图1兔RPE细胞TERT的阳性表达SABC ×400（略）

　　2.3ASODN对RPE细胞TERT表达的抑制免疫组织化学检测显示5 μmol/L和10 μmol/L的ASODN对TERT的表达有明显的抑制作用，其表达阳性率分别为(28.7±5.8)%，(26.3±6.2)%，而空白对照组TERT的表达阳性率为(37.6±4.6)%，与该对照组比较P<0.01，差异有统计学意义. SODN各浓度组作用下的阳性表达率与空白对照组相近，其差异无统计学意义(P>0.05, 表1).

　　2.4ASODN对RPE细胞增生活性的抑制作用ASODN 2.5， 5和10 μmol/L浓度组与0 μmol/L浓度组比较，细胞的A值差异有统计学意义. 这提示ASODN对RPE细胞的抑制作用可能具有剂量依赖性. SODN组各浓度与0 μmol/L浓度组比较，差异均无统计学意义(表2).

　　表1ODN作用下RPE细胞的TERT表达（略）

　　表2ODN作用下RPE细胞的增殖（略）

　　3讨论

　　PVR的病理过程实质为RPE在炎性因子等刺激下，移行、增生并有表型转化，分泌胶原，形成增生性的视网膜前膜及下膜. 膜的收缩表现为星形皱褶、弥漫性皱褶、环行或前部收缩，以及“餐巾环”、“晾衣杆”样改变，造成牵拉性视网膜脱离［6-7］. 鉴于RPE细胞的异常增生在PVR病变中起主要作用，抑制RPE细胞中端粒酶的活性成为防治PVR的一个方向. 端粒酶是端粒的核酸聚合酶，主要由端粒酶RNA组分(TR),端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒酶相关蛋白（TEP1）3个亚单位组成. 其中TERT是端粒酶的催化亚基，是决定端粒酶活性的限速因子. TERT可在端粒酶活性阴性的细胞异位表达，从而使端粒酶活性重现，使细胞寿命延长. 本实验证实，RPE细胞可表达TERT，其阳性表达率与细胞的增生活性呈正相关，提示TERT可能是PVR的发病机制之一. 与Oh等在心肌细胞、Minamino等在大鼠肺血管平滑肌细胞的研究中发现端粒酶活性显著增高相附，均提示TERT与细胞增殖密切相关［8-9］.

　　反义核苷酸技术是指按照碱基互补配对原则，选择与特定互补链(靶基因)特异性结合，干扰基因的复制、转录、剪切或翻译，从而阻碍某种蛋白合成的一类核酸研究新技术. 目前，作为基因的一种方法，正在将反义核苷酸作为一种潜在的药物进行疾病的治疗. 在细胞和组织内有各种核酸酶，能降解寡核苷酸，采取合适的修饰方法可以避免寡核苷酸的降解. 我们采用硫代修饰的ASODN(SASODN)，即核苷酸片段骨架磷上的羟基被巯基取代. SASODN具有良好的溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导激活大量核糖核酸酶H而被广泛应用，促进对RNA的降解；无论在细胞内外，SASODN均具有很强的抗核酸酶活性［10］. 本研究显示ASODN可显著抑制TERT在RPE细胞中的表达，而SODN则对TERT表达没有明显作用. 我们采用MTT比色法检测了ODN对细胞增生的影响，统计学分析显示ASODN对RPE细胞的体外增生有不同程度的抑制，并呈浓度依赖性，而SODN则无显著性影响，从而显示出ASODN序列特异性抑制基因表达及细胞增生的作用. 同时，在不同浓度ASODN的作用下，TERT的阳性表达率与RPE细胞的生长抑制有明显相关，提示TERT可能是RPE细胞增生的机制之一. ASODN对TERT的抑制作用为临床上治疗PVR提供了新思路，但其具体机制尚需进一步探讨.

　　【】

　　［1］ Dickson MA, Hahn WC, Ino Y. Human keratinocytes that express HTRET and also bypass a P16（INK4a）enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differetiantion characteristics［J］. Mol Cell Biol,2000,20(1):1436-1447.

　　［2］ Engelhardt M, Martens UM. The implication of telomerase activity and telomere stability for replicative aging and cellular immortality［J］. Oncol Rep,1998,5(1):1043-1052.

　　［3］ Reches A, Peddie C, Rendell S. Neoplastic transformation and cytogenetic changes after Gamma irradiation of human epithelial cells expressing telomerase［J］. Radiat Res,2001,155:222-228.

　　［4］ Cao Y, Li H, Mu FT, et al. Telomerase activation causes vascular smooth muscle cell proliferation in genetic hypertension［J］. FASEB J, 2002,16(1):96-98.

　　［5］ Kolquist KA, Ellisen LW, Counter CM, et al. Expression of TERT in early premalignant lesions and subset of cells in normal tissues［J］.  Nat Genet, 1998,19(2):182-188.

　　［6］ Jerdan JA, Pepose JS, Michels RG, et al. Proliferative vitreoretinopathy membranes: an immunohistochemical study［J］. Ophthalmology,1989,96(6):801-810.

　　［7］ Wu WC, Kao YH, Tseng HY. The cell cycle distribution of cultured human retinal pigmented epithelial cells under exposure of antiproliferative drugs［J］. J Ocul Pharmacol Ther, 2003,19(1):83-90.

　　［8］ Oh H, Taffet GE, Youker KA, et al. Telomerase reverse transcriptase promotes cardiac muscle cell proliferation, hypertrophy, and survival［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98(18): 10308-10313.

　　［9］ Minamino T, Mitsialis SA, Kourembanas S. Hypoxia extends the life span of vascular smooth muscle cells through telomerase activation［J］. Mol Cell Biol, 2001, 21(10):3336-3342.

　　［10］ Jiang YA, Luo HS, Zhang YY, et al. Telomerase activity and cell apoptosis in colon cancer cell by human telomerase reverse transcriptase gene antisense oligodeoxynucleotide［J］. World J Gastroenterol, 2003,9(9):1981-1984.