丙型肝炎病毒持续感染对体外培养人胎盘合体滋养层细胞MMP
【关键词】 肝炎病毒
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of HCV persistent infection on synthesis and secretion of MMP2 and MMP9 of human placental syncytiotrophoblast in vitro. METHODS: ELISA was employed to evaluate the effect of HCV persistent infection on secretion of MMP2 and MMP9 of human placental syncytiotrophoblast in vitro, and furthermore, gelatin zymography was used to validate the ELISA result. The effect of HCV persistent infection on synthesis of proMMP2 and proMMP9 mRNA was analyzed by RTPCR. RESULTS: The secretion of MMP2 and MMP9 of human placental syncytiotrophoblast in infection group decreased significantly （MMP2：t=4.186，P＜0.05； MMP9：t=2.325, P<0.05）; The synthesis of proMMP2 and proMMP9 mRNA of syncytiotrophoblast of infection group decreased in comparison with control group, but not significantly in statistics（proMMP2：t=1.196，P＞0.05；proMMP9：t=1.417，P>0.05）. CONCLUSION: HCV persistent infection suppressed the synthesis and secretion of MMP2 and MMP9 of human placental syncytiotrophoblast in vitro, which is not specific.
【Keywords】 gepatitis C virus; syncytiotrophoblast; MMP2; MMP9; in vitro
【摘要】 目的：探讨丙型肝炎病毒持续感染对体外培养人胎盘合体滋养层细胞MMP2和MMP9合成分泌的影响. 方法：应用ELISA方法检测细胞培养上清MMP2和MMP9水平，分析感染组和对照组数据间的差异，并用明胶酶谱进一步验证ELISA结果，随后应用RT－PCR法分析感染对细胞proMMP2和proMMP9 mRNA表达的影响. 结果：感染组细胞分泌MMP2和MMP9能力明显下降（MMP2：t=4.186，P<0.05； MMP9：t=2.325，P＜0.05）；RT－PCR结果显示感染组细胞proMMP2和proMMP9 mRNA表达弱于对照组，但差异不明显（proMMP2：t=1.196，P＞0.05；proMMP9：t=1.417，P>0.05）. 结论：丙型肝炎病毒持续感染时体外培养人胎盘合体滋养层细胞MMP2和MMP9合成分泌能力下降，为非特异性.
【关键词】 丙型肝炎病毒；合体滋养层细胞；金属蛋白酶2，9；体外
0引言
合体滋养层细胞的侵袭能力是其侵入母体子宫蜕膜及子宫螺旋动脉，参与形成胎盘（胎盘屏障）的生物学基础［1］. 我们前期研究证实体外培养人胎盘合体滋养层细胞可感染丙型肝炎病毒（HCV）且其侵袭能力可因持续感染而下降［2-3］. 研究表明，合体滋养层细胞的侵袭能力与金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase2, MMP2）和金属蛋白酶9（MMP9）密切相关. 合体滋养层细胞合成分泌MMP2和MMP9，降解细胞外基质（ECM），穿越ECM间隙，从而完成侵袭过程［4］. 我们通过ELISA、明胶酶谱分析以及RTPCR等方法研究HCV持续感染对合体滋养层细胞MMP2和MMP9合成分泌的影响，探讨HCV感染抑制合体滋养层细胞侵袭能力的具体分子机制.
1材料和方法
1.1材料Percoll细胞分离液为美国Pharmacia公司产品；免疫组织化学染色用ABC试剂盒购自华美生物工程公司,所用细胞角蛋白及波形蛋白抗体购自宝泰克生物工程公司；Matrigel人工重建基底膜材料购自BD公司；Transwell小室（8 μm）为Millipore公司产品；MMP2（Ab2）和MMP9（Ab1）鼠抗人PAb为Lab Vision产品；RNA提取试剂盒和RNA PCR试剂盒均为Promega公司产品. 实验所用感染血清来自第四军医大学唐都传染病科丙型肝炎住院患者,肝功能检验正常，血清抗HCV检测阳性,其他肝炎病毒标志物（HBVM，抗HAV，抗HEV，抗CMV，抗EBV）均阴性，抗HIV阴性. 扩增敏感试验定量检测HCV RNA 6.4×107拷贝/L，基因分型HCV1b型. 正常血清来自门诊体检人员，经检测HBsAg，抗HCV阴性，肝功能检验正常. 血清无菌采集，分装后-20℃冻存，用前经56℃，30 min灭活补体.
1.2方法
1.2.1人胎盘滋养层细胞的分离、纯化、培养及鉴定［2-3］应用我们改良的分离、纯化方法取得人胎盘滋养层细胞，胎盘绒毛组织取自第10周手术流产胎儿. 用ABC法进行的细胞角蛋白、波形蛋白染色对培养细胞进行鉴定.
1.2.2HCV体外感染实验将纯化后的细胞分别培养于培养瓶和12孔培养板中，培养基为正常含200 mL/L胎牛血清的高糖型DMEM培养液. 37℃，50 mL／L CO2孵箱内培养24 h后，进行第1次换液. 感染组换以含200 mL/L丙型肝炎患者血清和50 mL/L胎牛血清的DMEM培养液为培养基；培养于含200 mL/L正常人血清和50 mL/L胎牛血清的DMEM培养液的滋养层细胞为正常对照. 此后每24 h更换同样培养基一次，共5次. 第6次换液时，培养于培养瓶中的细胞更换同样培养基，培养24 h后胰酶消化细胞；培养于12孔培养板中的细胞换无血清DMEM培养液，培养24 h后取上清为检测标本.
1.2.3Matrigel人工重建基底膜侵袭实验将Matrigel包被好的Transwell小室放入24孔培养板中，小室外加入400 μL按1∶1混合的条件培养液（无血清培养24 h的NIH3T3细胞上清液）和完全培养液（含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液）. 用2.5 g/L的胰酶消化培养于培养瓶中的细胞，调整细胞浓度为1×109/L，然后将细胞悬液加到Transwell小室中，每小室100 μL，含10 mL/L胎牛血清的DMEM培养液为培养基. 感染组和对照组每组各6个样本. 37℃ 50 mL／L CO2温箱内孵育24 h后，取膜，甲醛固定，HE常规染色，用棉签将未穿过膜的细胞擦掉，封片. 每张滤膜于100倍光镜下随机挑取8个视野计数穿膜的细胞，取均值.
1.2.4培养上清MMP2和MMP9的ELISA检测留取12孔板内最后一次培养上清为检测样本. 双夹心酶联ELISA方法测定MMP2和MMP9水平，包被浓度20 mg/L. ELISA读数仪（ELx800，BIOTEK INSTRUMENTS.INC，USA）450 nm波长处测A值. 感染组和对照组每组各6个样本.
1.2.5明胶酶谱分析［5］将培养于培养瓶中的感染组和对照组胰酶消化后细胞100 μL（细胞浓度为1×109/L）重新接种于96孔培养板，完全DMEM培养液培养24 h，弃去培养上清，用PBS清洗2次后，换无血清DMEM培养液培养24 h. 收集无血清培养上清，低速离心（200 g）去除细胞碎片后进行SDSPAGE（明胶含量为1 g/L）电泳，电泳结束后凝胶洗脱液（25 mL/L Triton X100，50 mmol/L TrisHCl，pH 7.5）洗脱1 h，接着将凝胶置于孵育液（150 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2，50 mmol/L TrisHCl，pH 7.5） 37℃孵育过夜，考马斯亮蓝（1 g/L考马斯亮蓝，300 mL/L 异丙醇，100 mL/L冰醋酸）染色4 h，脱色液（100 mL/L甲醇，50 mL/L冰醋酸）脱色至蓝色背景出现透亮带. 光密度扫描下摄片.
1.2.6RT－PCR法检测培养细胞proMMP2和proMMP9 mRNA的表达用Promega公司的Total RNA Isolation System提取培养于12孔板内的细胞总RNA，操作严格按说明书进行. 分光光度法测定提取总RNA含量及纯度，A260 nm/A280 nm为1.8～2.0. 取1 μg RNA，用Promega RNA PCR试剂盒逆转录合成cDNA第一条链. 然后取合成的cDNA进行扩增，PCR 反应体系为20 μL，内含cDNA 2 μL，10×buffer 2 μL，4×dNTP(2 mmol/L) 2 μL，proMMP2，proMMP9引物，βactin引物（10 mmol/L）各2 μL，Taq酶16.67 nkat，超质量水补至20 μL. 反应参数为：97℃预变性2 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，30个循环；最后72℃延伸7 min. 取PCR扩增产物10 μL加入20 g/L的琼脂糖凝胶孔中电泳，溴化乙锭显色后成像定量分析，用MMP/βactin比值表示MMP表达水平. 感染组和对照组均设6个平行标本. 引物序列如下［6］：proMMP2 正义链 5′ACCTGGATGCCGTCGTGGAC3′，反义链 5′TGTGGCAGCACCAGGGCAGC3′； proMMP9 正义链 5′GTGCTGGGCTGCTGCTTTGCT3′， 反义链 5′GTCGCCCTCAAAGGTTTGGAA3′.
统计学处理:数据以x±s表示，采用两样本t检验（twosample ttest）分析两组间数据差异. 上述检验方法均采用SPSS 13.0统计软件处理.
2结果
2.1体外侵袭试验对照组和感染组均有细胞穿过铺有Matrigel胶的滤膜，穿膜细胞数分别为65.00±4.91（n=6）和34.83±3.93（n=6），感染组低于对照组，差异具有统计学意义(t=11.751，P＜0.05).
2.2ELISA检测所选抗体均可识别培养上清中酶原形式以及特异性蛋白酶水解后的MMP2和MMP9. ELISA检测结果显示，感染组细胞培养上清MMP2和MMP9水平均低于对照组，差异具有统计学意义（MMP2：t=4.186，P＜0.05； MMP9：t=2.325，P＜0.05, 图1）.
2.3明胶酶谱分析细胞培养上清中MMPs主要以酶原形式存在，且感染组Mr为92×103（proMMP9）和Mr为72×103（proMMP2）处条带均弱于对照组（图2），表明感染组细胞培养上清中MMP9和MMP2的酶活性均低于对照组，进一步证实了ELISA检测的结果.
2.4RTPCR检测感染组细胞proMMP2和proMMP9 mRNA表达水平弱于对照组，但差异不明显，无统计学意义.
3讨论
MMPs是一类能降解细胞外基质（ECM）的锌离子依赖性内肽酶. 到目前为止，已发现有29个家族成员［7］，其中MMP2（pro form，Mr 72×103；active form，Mr 66×103）和MMP9 （pro form，Mr 92×103；active form，Mr 86×103），又称IV型胶原酶或明胶酶（gelatinases），是参与合体滋养层细胞侵袭的关键酶［8］. 在囊胚植入内膜，胎盘尚未形成前（7～11 wk），人合体滋养层细胞同时分泌酶原形式的proMMP2和proMMP9，随后其被特异性蛋白酶分解为MMP2和MMP9，参与胚胎的植入过程及胎盘（胎盘屏障）的形成［8］. 合体滋养层细胞的侵袭能力依赖于MMP2和MMP9的正常合成分泌，其能力的降低可导致细胞对子宫螺旋动脉浸润不足，影响妊娠生理性胎盘床血管重铸，使胎盘血流灌注不足，导致胎盘缺血缺氧，影响胎儿发育，甚至导致流产［9］.
我们前期研究发现，HCV可持续感染体外培养的人胎盘滋养层细胞且可导致合体滋养层细胞侵袭能力以及侵袭相关的黏附、运动能力的下降. 本实验我们应用ELISA和明胶酶谱分析等方法研究HCV持续感染对体外培养滋养层细胞MMP2和MMP9的分泌影响，证实感染能抑制细胞MMP2和MMP9的分泌. 在实验中，我们发现感染组proMMP2和proMMP9 mRNA表达水平虽低于对照组，但差异不显著. 根据这一结果，我们认为体外培养人胎盘合体滋养层细胞侵袭能力下降是合体滋养层细胞分化不成熟的结果，RTPCR实验结果的差异可能为感染组存在相对多数不具备合成分泌MMP2和MMP9能力的细胞滋养层细胞所致. HCV持续感染并不能特异性抑制细胞MMP2和MMP9的分泌能力.
合成分泌激素是合体滋养层细胞的另一项重要的生物学功能，其分泌的HCG、HPL、妊娠特异性β1糖蛋白（PSβ1G）、雌激素、缩宫素酶、耐热性碱性磷酸酶等对胎盘的生成、妊娠的维持以及胎儿的发育等有重要的意义［10-11］. 我们前期以培养上清HCG为检测因子，评估感染细胞激素合成能力的变化，发现HCV持续感染可明显抑制细胞激素的合成能力，而合成能力下降所致培养上清激素水平的降低可直接导致细胞分化成熟障碍,加之我们前期研究发现HCV持续感染可致细胞超微结构出现脂滴减少等变化［12］，因此我们认为，细胞激素合成分泌能力下降所致细胞分化成熟障碍是细胞侵袭能力以及侵袭相关的黏附、运动能力的下降的主要原因.
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