bcl2基因转染对人胃上皮细胞GES

           作者：朱丽华，李淑英， 周洪霞，习瑾昆，章广玲，周天戟

【关键词】  bcl2基因

    【Abstract】 AIM：To observe the effect of bcl2 gene transfection on the proliferation of human gastric epithelial cell GES1. METHODS：The eukaryotic vector carrying the full length of bcl2 gene and the neomycin resistance gene (pcDNA3/bcl2) and the one only carrying the neomycin resistance gene (pcDNA3) were amplified and purified. The plasmid of pcDNA3/bcl2 was used to transfect GES1 cells by using the lipofectamine, and the empty vector pcDNA3 to transfect GES1 cells as controls. And then, the cells were cultured in 1640 culture medium containing an appropriate concentration of G418 for selection. The method of HRP label immunohistochemical staining was used to identify the cells expressing bcl2 gene positively. The morphologic changes of GES1 cells were observed under an optical microscope by HE staining. The cell proliferation affected by the transfection of bcl2 was measured by cell counting and MTT assay. RESULTS: bcl2 gene and the vector pcDNA3 were transfected separately into GES1 cells by lipofectamine. After G418 selection, the cells were transfected steadily. Compared with controls, HRP label immunohistochemical staining showed that bcl2 gene transfected cells expressed Bcl2 protein much more obviously. No morphologic changes were observed by HE staining. The growth curve was drawn by the method of cell counting，which showed that the growth of bcl2 gene transfected cells was faster than that of empty vector transfected cells and  untransfected cells after 6 d culture. And MTT assay showed that the growth of bcl2 gene transfected cells were 4.15±0.31，5.98±0.56 and 8.94±0.79, respectively. While MTT assay showed that the growth of control cells were 3.01±0.20， 4.76±0.52 and 7.69±0.84, respectively. Significant differences were found between the 2 groups (P<0.05). CONCLUSION: The transfected of bcl2 gene makes the cells express Bcl2 protein steadily and highly, and enhances the cells proliferation and malignancy.

    【Keywords】 bcl2 gene; transfection; gastric mucosa; epithelial cell; GES1; proliferation

    【摘要】 目的：观察bcl2基因脂质体法转染人胃上皮细胞系GES1及其转染后对GES1细胞增殖的影响. 方法：以脂质体法转染构成bcl2基因表达的人胃上皮细胞系GES1细胞模型，空载体质粒pcDNA3转染GES1细胞及正常GES1细胞为对照；经酶标免疫组织化学法鉴定bcl2基因表达阳性细胞；用HE染色法进行形态学观察；并采用细胞计数及MTT法分析bcl2转染后对GES1细胞增殖的影响. 结果：脂质体法转染bcl2基因后，细胞高表达Bcl2蛋白；HE染色后形态学观察无明显改变；细胞计数法绘制细胞生长曲线结果显示bcl2基因转染6 d后细胞生长速度明显超过对照组，MTT法结果显示bcl2基因转染第24,48,72 h， A490 nm值分别为4.15±0.31，5.98±0.56，8.94±0.79，对照组分别为3.01±0.20，4.76±0.52，7.69±0.84，两组相比较具有显著性差异(P<0.05). 结论：bcl2基因转染使GES1细胞稳定且高表达Bcl2蛋白，并促进了细胞增殖.

    【关键词】 bcl2基因；转染；胃黏膜；上皮细胞；GES1；增殖

       0引言

    胃癌的发生是一个多因素、多阶段的过程. bcl2是近年发现的细胞凋亡调控基因，其异常表达与胃癌、宫颈癌、胃肠道等肿瘤发生发展尤为密切［1-3］. 我们探讨bcl2基因在人胃上皮细胞系GES1中的表达情况，探讨该基因表达量与人胃上皮细胞生长特性之间的关系如下.

    1材料和方法

    1.1材料正常人胃上皮细胞系GES1，本室保存；质粒pcDNA3由日本北海道大学医学部遗传医学研究所肿瘤病毒学部门高田贤藏教授惠赠；Lipofectamine、DMEM培养液、RPMI 1640培养液、MTT、胎牛血清购于Gibco公司；小鼠抗Bcl2（一抗）、HRP标记山羊抗小鼠IgG（二抗）购于北京华美生物制品公司；Olympus光学显微镜为日本Nikon公司产品.

    1.2方法细胞稳定转染参照Lipofectamine［4］转染说明书进行，基因转染48 h后，换用含300 mg／L G418的完全培养基筛选. 取待染细胞爬片，固定，滴加30 mL/L H2O2，室温孵育15 min，滴加1∶100稀释的小鼠抗Bcl2 mAb，4℃湿盒中过夜，PBS洗，滴加山羊抗小鼠IgG HRP结合物，37℃，孵育30 min， PBS洗涤，DAB溶液显色5 min，PBS终止反应；自来水充分冲洗，系列乙醇脱水，二甲苯使其透明，中性树胶封片，检测转染细胞中Bcl2蛋白的表达. 转染bcl2的GES1细胞经HE染色进行形态学观察并照相. 另接种细胞于24孔培养板中，每孔接种3×106/L. 每天取3个孔计数，测出每孔中的细胞总数，求出每组平均值，持续计数10 d, 绘制生长曲线. 细胞接种于96孔培养板中，培养24,48,72 h后每孔加入MTT溶液（5 g/L） 20 μL，37℃，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液. 每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解. 选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各A值，记录结果. 空载体质粒pcDNA3转染GES1细胞及正常GES1细胞为对照.

    统计学处理:实验结果以x±s表示，用SPSS 11.5软件包进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，两两比较使用Dunnettt检验.

    2结果

    2.1转染细胞中Bcl2蛋白表达与对照组(GES1和GES1/PcDNA3组)比较，免疫组织化学染色法显示bcl2基因转染细胞均有Bcl2蛋白表达，且明显高于对照组（图1）. 另经HE染色，光镜观察，bcl2基因稳定转染细胞后，细胞形态未见改变.

    2.2细胞生长速度绘制生长曲线结果表明bcl2基因转染细胞于第4日后生长速度明显高于对照组（图2）. 培养24,48和72 h转染组细胞的增殖明显增高，经统计学分析，转染组和对照组相比较，有统计学差异（P<0.05,表1）.表1bcl2基因转染后细胞的增殖（略）

    3讨论

    Bcl2高表达是对各种凋亡刺激的保护，因此Bcl2低表达或缺失的细胞死亡率明显增加. bcl2基因被证明在抑制细胞向凋亡的转变中起重要作用,可以抵抗和抑制多种因素诱导的细胞凋亡，增强细胞的存活力，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控［5-6］. 转染bcl2基因可抑制化疗药物、加热、放射线、细胞生长因子撤销、cmyc或p53基因等多种因素诱导的多种细胞的凋亡，延长细胞生存时间［7-8］. 我们用脂质体介导的基因转染法，将含有人bcl2cDNA的真核表达载体pcDNA3导入人胃上皮细胞系GES1，成功地建立了100％稳定表达Bcl2蛋白的GES1bcl2.

        【】

    ［1］ 史朝晖,姜希宏,靳文武,等. 抑凋亡基因bclx  L在胰腺癌组织中的表达及意义［J］. 山东医药,2003,43（36）:9-10.

    ［2］ 夏克栋, 陈向敏, 林巧爱, 等. NFKb、IKb、Bcl2在宫颈癌组织中的表达及其与人乳头瘤病毒感染的关系［J］. 癌症,2005,24（11）:1350-1353.

    ［3］ 孙梅，张兴义，邹洪杰，等. CyclinD1、Ki67和Bcl2在胃肠道间质瘤的表达及与其预后的关系［J］. 中华胃肠外科杂志,2005,8（6）:542-543.

    ［4］ 王贤辉, 梁米芳, 李德新, 等. 鼠bclX_L基因在CHO细胞中的表达［J］. 第四军医大学学报,2003,24（24）:2217-2219.

    ［5］ 李俊峡, 贾国良, 金明, 等. 转染bcl2基因对心肌细胞活力的影响［J］. 第四军医大学学报,2003,24（2）:110-112.

    ［6］ 王长洪, 陆宇平, 冯新莉, 等. 黄苔胃病患者胃黏膜凋亡基因及相关蛋白的表达［J］. 中西医结合消化杂志,2004,12（1）:13-14.

    ［7］ 姬峻芳,詹启敏, 吴. Bcl2与P53的相互作用［J］. 医学分子生物学杂志,2005,2（2）:102-104.

    ［8］ Kanda T,Yokosuka O,Imazeki F, et al. Enhanced sensitivity of human hepatoma cells to 5 fluorouracil by small interfering RNA targeting Bcl2［J］. DNA Cell Biol, 2005,24(12):805-809.