小鼠IL12基因转染对人卵巢癌Skov3细胞的生长及细胞因子的表达

【关键词】  基因转染

     　Effect of mouse IL12 gene transfection on the growth of ovarian cancer Skov3 cells and the expression of related factors

      【Abstract】 AIM: To investigate the effect on the proliferation of ovarian cancer Skov3 cells and the expression of related factors, by the plasmid with mouse IL12 gene transfected into Skov3 cells, which cultured with spleen cells in vitro. METHODS: Human ovarian cancer Skov3 cells were transfected with mouse IL12 gene by lipofect. The expressions of IL12 and INFγ were detected by ELISA, and the effects on the proliferation of Skov3 ovarian cancer cells were evaluated by MTT. RESULTS: A high expression level of IL12 (473±38) ng/L was found 48 h after transfection, more higher than that in control group (13-17 ng/L, P＜0.05). Ovarian cancer cells could produce INFγ under the influence of spleen cells, and the highest level (173±18) ng/L emerged 24 h after transfection, which also was significantly different from untransfected group (P＜0.05). Skov3 ovarian cancer cells proliferation was restrained by IL12 when they were cultured with spleen cells (P＜0.05). Immunochemistry revealed that the cancer cells could produce  IL12 after transfection, and the latter could restrain the proliferation of Skov3 ovarian cancer cells. CONCLUSION: The IL12 genes could be transfected into Skov3 ovarian cancer cells to product IL12 and relative cell factors, which could restrain the proliferation of the cells and then kill the carcinoma cells of ovary.

    【Keywords】 interleukin12; ovarian neoplasms; genetherapy

    【摘要】 目的：观察含小鼠IL12全长基因的质粒转染到Skov3人卵巢癌细胞中，在脾细胞存在的情况下对肿瘤细胞的影响及相关细胞因子的表达. 方法：脂质体转染技术将基因转染至Skov3人卵巢癌细胞中，ELISA方法检测IL12及INFγ的表达，MTT方法检测对Skov3卵巢癌细胞增殖的影响. 结果：转染后48 h检测到IL12的高表达，约(473±38) ng/L；而未转染组约13~17 ng/L，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）. 在脾细胞作用下产生INFγ，以作用后24 h表达量高，约(173±18) ng/L，较未转染组高，比较有统计学意义(P＜0.05). 转染后癌细胞免疫组化可见IL12表达，在脾细胞的作用下，IL12对Skov3卵巢癌细胞有抑制其增殖的作用(P＜0.05). 结论：可以将IL12基因转染至Skov3人卵巢癌细胞中并表达IL12，脾细胞检测其活性并有相应的细胞因子产生，对Skov3细胞有抑制其增殖作用，从而杀伤卵巢癌细胞，具有抗肿瘤作用.

    【关键词】 白细胞介素12；卵巢肿瘤；基因

       0引言

    肿瘤生物学治疗的许多细胞因子中IL12是最有效的［1］. 它具有明显的抗原发和转移瘤的作用，且毒性远比IL2低，成为广大学者研究的热点之一. 卵巢恶性肿瘤在盆腔内生长，易于转移而广泛播散，复发率、转移率均较高. 杨红等［2］将β葡萄糖醛酸苷酶基因转入卵巢癌细胞以探索卵巢癌临床基因治疗. 我们将含有小鼠IL12全长基因的质粒转染至Skov3人卵巢癌细胞中，观察其表达情况及其相关细胞因子的表达，评价其抗肿瘤效果，探讨临床应用的可行性.

    1材料和方法

    1.1材料人卵巢浆液性乳头状囊腺癌Skov3细胞株（美国Memorial Sloan Kattering Cancer Center）用含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640 (Gibco公司产品)培养液，在37℃，50 mL/L CO2条件下培养，隔天换液，细胞长满单层后用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代. 含有全长小鼠IL12质粒［PCAGGSIL12 (7.1 kb)［PCAGGSIL12P35TRESIL12P40］的大肠杆菌（哈尔滨医科大学微生物教研室）；成年KM小鼠2只，购于黑龙江省肿瘤研究所实验动物中心；脂质体转染试剂盒Roche公司产品.

    1.2方法将已经转化质粒［PCAGGSIL12(7.1 kb)［PCAGGSIL12P35TRESIL12P40］的大肠杆菌菌株加入LB培养基5 mL中，置于37℃摇床中24 h，传代过夜，见培养基较浑浊后进行提取，-20℃保存并取25 μL质粒溶液加入蒸馏水1 mL中，分光光度计260，280 nm下观察A值，得到质粒的浓度和纯度. DNA浓度公式：c(mg/L)=A260 nm/0.20;DNA纯度公式：A260 nm/A280 nm. 将Skov3细胞制成单细胞悬液，以1×106接种于6孔板中. 贴壁后，用不含血清和抗生素的RPMI 1640培养液洗板3次，将含有质粒和脂质体的混合液（25 μL+50 μL=75 μL）轻轻混匀放置10 min后将混合液加入6孔板中，设无小鼠IL12基因的空白质粒为对照. 置37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养，6 h后更换含100 mL/L胎牛血清的培养液，于孵箱中继续培养进行转染. 收获不同时间（24，48，72 h）的培养上清按小鼠IL12 ELISA试剂盒说明建立标准曲线，于转染后24，48，60 h检测上清IL12表达水平. 以未转染的Skov3为对照.

    取成年KM小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，加RPMI 1640培养液3 mL混匀培养，稀释10倍后细胞记数器记数：C（个/mL）=(A+B+C+D)/4×10×104. 吸取转染后48 h的上清，加入脾细胞悬液中（约含1.0×106脾细胞），培养0，24，48 h，分别检测INFγ表达；收集转染后的Skov3卵巢癌细胞，将脾细胞悬液（约含1.0×106脾细胞）加入其中，共同培养24，48 h后，收集上清，检测INFγ表达.以未转染的Skov3 A值为对照MTT法检测Skov3卵巢癌细胞抑制率=［（A对照组-A实验组）/A对照组］×100%

    统计学处理：全部数据经统计软件SPSS 10.1处理，组间比较用方差分析，P<0.05为有统计学意义.

    2结果

    质粒浓度=0.54 μg/L；DNA纯度：A260 nm/A280 nm=0.18. 转染后Skov3细胞光镜下形态未见明显变化（图1）.

    2.1小鼠IL12的表达转染后24，48及60 h IL12表达水平（μg/L）分别为75±9，473±38，522±32；而未转染组分别为13±4，16±4，17±6. 转染后组IL12表达水平较未转染组明显增高， 48和60 h的表达有统计学差异（P＜0.05）.

    2.2INFγ的表达转染后48 h上清与脾细胞悬液共同培养作用0，24，48 h，ELISA方法检测得INFγ的表达水平（μg/L）分别为：32.0±2.1，82.0±3.2，30.0±1.0，其中共同作用24 h INFγ表达水平较高；转染48 h后Skov3卵巢癌细胞中加入脾细胞悬液（约1.0×106），共同培养24，48 h后，收集上清检测INFγ的表达，测得INFγ表达水平（μg/L）分别为：185.0±17.6，157.0±7.2. 转染后的Skov3卵巢癌细胞与脾细胞共同作用24 h后可测得高水平INFγ的表达.  提示转染后Skov3的卵巢癌细胞持续分泌的IL12能促进效应细胞（脾细胞）产生持续高水平的INFγ表达. 脾细胞与转染后Skov3的卵巢癌细胞（T Skov3+S）共同作用24 h后，A490 nm为0.735±0.036，与未转染的Skov3卵巢癌细胞A490 nm 2.040±0.124比较有差异（P＜0.05）；与未转染的Skov3+S作用后的A490 nm值2.038±0.228比较差异有统计学意义（P＜0.05）. 而TSkov3，Skov3，Skov3+S，Skov3组比较差异无统计学意义. 转染后的Skov3卵巢癌细胞与脾细胞共同作用24 h后，对卵巢癌的抑制率为64.0%，表明在脾细胞存在共同作用下小鼠IL12对Skov3卵巢癌细胞的增殖有明显的抑制作用.

       3讨论

    细胞因子疗法是肿瘤生物疗法之一. Yamazaki等［3］将含有鼠IL12基因的质粒转导到BCG中，发现能够检测到IL12, INFγ的高表达并且增加了BCG的肿瘤杀伤效应. 王克敏等［4］将含有小鼠IL12基因与MHCI基因的质粒采用脂质体转染法转染到肝癌细胞株中，用ELISA方法测得上清中小鼠IL12表达为48 ng/L. 我们以脂质体转染技术将含有鼠全长IL12基因的质粒转染到Skov3卵巢癌细胞中，脂质体作为基因载体较病毒载体的优点是安全、操作简单、转染成功率较高,但转染率较低，因此IL12表达水平不是特别高，较相关报道水平低.

    INFγ具有较强的抗肿瘤作用［5-6］, 能够抑制肿瘤生长，并能抑制机制转移蛋白酶，从而抑制肿瘤转移. IL12通过诱导INFγ的产生，抑制肿瘤.

    本实验结果显示在部分效应细胞脾细胞的存在下，小鼠IL12对卵巢癌细胞的抑制杀伤作用，并检测了相应的效应因子的表达，初步探讨了其在卵巢癌细胞中的抗肿瘤作用. 由于细胞因子间相互作用是一个复杂的，本研究中的细胞因子种类有限，不能全面解释IL12的抗卵巢癌作用，尚需继续完善.

    【文献】

    ［1］ Gorelik E, Edwards RP, Feng X, et al. IL12 receptormediated upregulation of FasL in human ovarian carcinoma cells［J］. Int J Cancer, 2004, 112(4): 620-627.

    ［2］ 杨红，辛晓燕，秦卫军. β葡萄糖醛酸苷酶基因转染人卵巢癌细胞的生物学特性［J］. 第四军医大学学报, 2003, 24（17）: 1575-1577.

    ［3］ Yamazaki M, Zhang R, Straus FH, et al. Effective gene therapy for medullary thyroid carcinoma using recombinant adenovirus inducing tumorspecific expression of interleukin12 ［J］. Gene Ther, 2002, 9(1): 64-74.

    ［4］ 王克敏，夏爱娣，陈诗书. 质脂体介导Mil12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠试验性肝癌的治疗作用［J］.  癌症, 2002, 21（10）: 1041-1046.

    ［5］ Comes A, Carlo ED, Musiani P, et al. IFNγindependent synergistic effects of IL12 and IL15 induce antitumor immune responses in syngeneic mice［J］. Eur J Immunol， 2002, 32(7): 1914-1923.

    ［6］ Yun CH, Lundgren A, Azem J, et al.  Natural killer cells and Helicobacter pylori infection: Bacterial antigens and interleukin12 act synergistically to induce gamma interferon production［J］. Infect Immun, 2005, 73(3): 1482-1490.