荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用

【关键词】  荔枝核；黄酮类；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用

    【Abstract】 AIM: To evaluate the antirespiratory syncytial virus (RSV) effect of flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis in cell culture in vitro.  METHODS: By the method of cell culture and using ribavirin as a positive control, the cytopathic effect(CPE) was observed.  RESULTS: The TC50 and IC50 of the flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis was 152.9 mg/L and 58.6 mg/L respectively. The  therapeutic index (TI) was 2.6, It had the same effect as Ribavirin in antiRSV. Moreover, flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis also showed a concentrationdependent response in inhibiting RSV.  CONCLUSION: Flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis can inhibit RSV in Hep2 cells in vitro.

    【Keywords】 semen litchi; Flavones;　respiratory syncytial viruses (RSV);  antiviral effect

    【摘要】　目的： 探讨荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用.  方法： 采用细胞培养技术，以病毒唑为阳性对照，观察比较荔枝核黄酮类化合物对RSV引起的细胞病变(CPE)的抑制作用.  结果： 荔枝核黄酮类化合物半数中毒浓度(TC50)为152.9 mg/L，其抗RSV的半数有效浓度(IC50)为58.6 mg/L，指数(TI)为2.6，体外抗RSV作用与病毒唑相当，且对RSV抑制作用存在明显的量效关系.  结论： 荔枝核黄酮类化合物在Hep2细胞中对呼吸道合胞病毒有抑制作用.

    【关键词】　荔枝核；黄酮类；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用

     荔枝核是无患子科植物荔枝（Litchi Chinensis Sonn）的成熟种子. 又名荔仁或荔核，味甘、微苦，归肝、肾经. 功效行气散结、祛寒止痛. 荔枝核的化学成份包括甾类、皂甙、挥发油、鞣质、脂肪酸、聚合花色素成份、糖类、蛋白质以及无机盐［1-2］. 荔枝核有降血糖、调血脂和抗氧化、保肝作用. 其水提取物及黄酮类化合物的体外实验表明，荔枝核对乙肝病毒HBsAg, HBeAg, HBVDNA有明显的抑制作用［3-4］. 我们旨在探讨荔枝核是否具有抗呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)的作用.

    1材料和方法

    1.1材料MTT（4,5二甲基噻唑2,5二苯基四唑溴化物，Sigma公司)，以无血清MEM培养基配制成5 g/L溶液，过滤除菌后置4℃冰箱保存备用；MEM和RPMI 1640(Gibico公司)；二甲基亚砜（DMSO，上海菲达有限公司)；新生小牛血清(杭州四季清公司)；10 mL/L鸡血由来亨公鸡翅下静脉取血，按1∶4加入Alserver液后4℃保存，使用时用生理盐水配成10 mL/L鸡红细胞悬液；RSV毒种为RSVLong株（香港中文大学），于Hep2细胞中活化增殖，当细胞病变（CPE）达75%以上（～）时收获，滴定RSV滴度为1×108TCID50(半数感染量)/L； Hep2细胞（武汉大学典型培养物保藏中心），细胞生长液为RPMI 1640中加100 mL/L小牛血清、1×105 U/L青霉素及100 mg/L链霉素，细胞维持液除小牛血清为20 mL/L外，其余同细胞生长液；中药荔枝核黄酮类化合物由桂林医学院药理实验室提取分离，经定性试验和盐酸―镁粉检测为黄酮类化合物，总黄酮含量达853 g/kg，将药物用纯净水配成100 g/L 水剂，过滤除菌；阳性对照药病毒唑（又名利巴韦林， Ribavirin，湖北医工所，批号0301006），用生理盐水稀释至100 g/L备用.

    1.2方法

    1.2.1药物对Hep2细胞的毒性作用根据［5］检测药物对Hep2细胞的毒性作用. 用胰酶将生长良好的Hep2细胞分散成单个细胞悬液，按1×108/L的细胞密度分种于40孔板，每孔0.1 mL. 置37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h. 待细胞长成单层后弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液，每种浓度重复4孔，并设正常细胞对照. 继续培养48 h后弃培养液上清，每孔加入含5 g/L MTT的无血清MEM培养基50 μL，置CO2培养箱中继续培养2～3 h后弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液（DMSO： 乙醇体积比为1∶1）100 μL，振荡5～10 min，待结晶完全溶解后于96孔酶标测定仪上测定A570 nm值，并根据下式细胞存活率，计算药物对细胞的最大无毒浓度范围. 细胞存活率（%）=（实验孔A570 nm/对照孔A570 nm）×100%.

    1.2.2药物对RSV增殖的抑制作用在已长成单层Hep2细胞的40孔板上接种RSV，每孔50 μL（100 TCID50），33℃吸附90 min后弃病毒上清. 根据细胞毒性实验的结果，在药物无毒浓度范围内加入不同浓度的含药维持液，每孔0.2 mL，然后将RSV培养板置33℃，50 mL/L CO2培养，每日观察CPE. 隔日换新鲜含药维持液. 实验同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性药物病毒唑组和药物组. 当细胞发生病变时，细胞出现肿胀、变圆，折光性减弱，有合胞体形成. CPE记录方法为： -为无CPE，+为1%至25%细胞出现CPE. 为26%至50%细胞出现CPE；为51%至75%细胞出现CPE；为76%至100%细胞出现CPE. 约在病毒对照孔为～时弃培养液上清，每孔加入含5.0 g/L MTT的培养液50 μL，继续培养2～3 h后洗去MTT上清，每孔加DMSO溶解液100 μL，混匀5～10 min后测A570 nm值. 并按下述公式计算药物对RSV抑制率. 病毒抑制率（%）=（药物处理组A570 nm-病毒对照组A570 nm）/（细胞对照组A570 nm-病毒对照组A570 nm）×100%.

    统计学处理： 用统计软件PEMS 3.1的加权直线回归法计算药物半数毒性浓度TC50和半数有效浓度IC50，得到药物治疗指数（Treatment Index, TI=TC50/IC50）.

    2结果

    2.1药物对Hep2细胞毒性作用表现Hep2细胞变圆，壁厚，胞质内颗粒增加，折光性增强. 不同浓度的荔枝核黄酮类化合物对Hep2细胞存活率的影响结果见表1.

    表1不同浓度的荔枝核黄酮类化合物对Hep2细胞存活率的影响（%）

    药物〖〗药物浓度（mg/L）10〖〗20〖〗40〖〗80〖〗160〖〗320〖〗640〖〗800〖〗1600〖〗50%毒性

    浓度TC50〖BHDG2，WK7*4/5ZQ，WK6DW，WK5DW，WK6DW，WK5DW，WK5DW，WK5DW，WK5DW，WK5DW，WK5DW，WK7DWW〗荔枝核黄酮类化合物〖〗100.0〖〗80.5〖〗74.3〖〗64.0〖〗53.0〖〗35.1〖〗25.5〖〗12.4〖〗8.6〖〗152.9病毒唑〖〗100.0〖〗80.2〖〗76.5〖〗65.0〖〗52.5〖〗34.2〖〗25.1〖〗13.2〖〗8.5〖〗154.9

    2.2药物对RSV增殖的抑制作用RSV对Hep2细胞CPE表现为细胞肿胀、变圆，折光性减弱，有合胞体形成. 根据细胞毒性实验的结果，选择在无毒浓度范围内，将药物分别以不同的浓度进行抑制RSV实验，其病毒抑制率见表2.表2不同浓度的荔枝核黄酮类化合物作用后RSV病毒抑制率的变化