复脑汤在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用及其机制

                 作者： 刘素蓉，王敏，吴喜利，高艳琼

【关键词】  再灌注损伤；超氧化物歧化酶；肿瘤坏死因子

   【Abstract】 AIM: To investigate the neuroprotective mechanism of Funao decoction in the treatment of repeated cerebral ischemia/reperfusion injury. METHODS: Totally 70 mice were randomly divided into 7 groups of 10 mice each: blank control group, sham operated groups of 1 and 10 d, model groups of 1 and 10 d, herb groups of 1 and 10 d (Funao decoction). The mice in the herb groups were perfused gastrically with Funao decoction, while those in the other groups with distilled water, both followed by cerebral ischemia/reperfusion 5 d later. One or 10 d after operation, the brains were taken following rapid decapitation to measure the activity of superoxide dismutase (SOD) and the contents of malondialdehyde (MDA), tumor necrosis factorα (TNFα) and interleukin1β (IL1β). RESULTS: The activities of  SOD were significantly reduced to (13.95±4.52) mg/g and (15.82±4.39) mg/g respectively at 1 and 10 d after cerebral ischemia/reperfusion, as compared with the control group ［(26.82±3.58) mg/g］; while the contents of MDA, TNFα and IL1β were significantly increased. In comparison with the model group, Funao decoction was effective to increase the activity of SOD ［(21.35±4.07) mg/g, F=16.56, Q=3.29, P<0.05］ and decrease the contents of MDA (F=81.88, Q=34.61，P<0.01). Funao decoction played a downregulative role in the contents of TNFα and IL1β (F=96.44，Q=35.11，P<0.01; F=38.30，Q=40.92, P<0.01). CONCLUSION: Funao decoction plays a neuroprotective role against  the repeated ischemia/reperfusion injury through reducing the oxidation and downregulating the expressions of TNFα and  IL1β in the brain.

   【Keywords】 reperfusion injury; SOD;TNFα; IL1β

   【摘要】 目的: 探讨复脑汤在反复脑缺血再灌注损伤中的神经保护机制. 方法: 实验分为空白对照组、假手术组、模型组和复脑汤组. 实验期间空白对照组、假手术组和模型组以蒸馏水灌胃，复脑汤组以复脑汤灌胃，用药5 d后实施脑缺血再灌注术. 手术后第1，10日，小鼠断头取脑测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素1β(IL1β)的含量. 结果：与对照组(26.82±3.58) mg/g相比，模型组鼠脑缺血再灌注后SOD活性第1日（13.95±4.52） mg/g和第10日（15.82±4.39） mg/g明显降低，MDA,TNFα，IL1β含量显著升高. 与模型组相比，复脑汤能显著提高SOD［（21.35±4.07） mg/g］的活性(F=16.56,q=3.29,P<0.05)，并降低MDA的水平（F=81.88, q=34.61,P<0.01）. 复脑汤组能显著下调小鼠大脑皮质TNFα（F=96.44,q=35.11,P<0.01）和IL1β（F=38.30, q=40.92,P<0.01）的水平. 结论: 复脑汤通过降低脑缺血再灌注后脑氧化反应以及TNFα和IL1β表达而起到神经保护作用.

   【关键词】 再灌注损伤；超氧化物歧化酶；肿瘤坏死因子α；白细胞介素1β

    血管性痴呆（vascular dementia, VD）是指与血管因素有关的痴呆，VD是发生在脑血管病基础上的以记忆、认知功能缺损为主，或伴有语言、空间技能及情感或人格障碍的获得性智能的持续性损害. 痴呆越来越成为影响中老年人健康和生活质量的常见病、多发病，并且随着我国人口老龄化的不断，将给社会和家庭带来沉重负担.有资料显示，脑动脉阻断后即使立即再通，脑组织的损伤也不能完全恢复正常，而且不能完全挽救由缺血造成的继发性脑损伤范围的继续扩大［1］. 其最主要的病理因素为反复性的脑缺血［2］. 缺血后脑神经死亡的可能机制一是由于缺血、缺氧直接导致神经元死亡；二是迟发性神经元死亡［3］，目前，较多的研究兴趣集中在缺血再灌注后的自由基损伤及炎性过程，而肿瘤坏死因子α（TNFα）或者白细胞介素1β（IL1β）又是此炎性过程的关键因素［4-5］. 资料显示中药可明显改善血管性痴呆鼠的学习与记忆功能［6］. 结合医学，发掘中医药特色，我们对本病进行了数年的中医及证候研究. 通过对VD证候演变与痴呆病情发生发展关系的观察，对VD病因病机有了进一步的认识. 在此基础上我们拟定了益气醒脑、活血化瘀的治法，自拟复脑汤，临床疗效显著. 为探讨其作用机制，我们观察了复脑汤对脑缺血再灌注后超氧化歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）水平和TNFα,IL1β表达的作用.

   1材料和方法

   1.1材料选用西安大学实验动物中心昆明种雄性小鼠70只，体质量(20±2) g.完全随机分为7组：空白对照组，假手术组第1,10日组，模型组第1，10日组，复脑汤组第1，10日组. 每组各10只，分笼饲养. 药物及试剂：复脑汤由人参12 g，石菖蒲6 g，水蛭3 g，川芎10 g等16味药物组成. 所有药物均由西安交通大学第二附属中药房提供并配制成1 kg/L (含生药量）浓缩液，SOD，MDA，TNFα，IL1β检测试剂盒购自北京中山生物技术公司.

   1.2方法实验期间，空白对照组喂以固体平衡饲料，模型组及各用药组喂以高脂饲料. 模型组及各用药组以高脂饲料喂养1 mo后，检测其血脂证实已增高后进行造模. 用200 g/L乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，无菌颈正中切口，分离双侧颈总动脉并穿以0号丝线. 阻断血流使其缺血10 min，然后再通10 min，如此反复3次，最后恢复血供，缝合切口. 术中及术后保持小鼠体温. 假手术组仅行颈正中切口并游离双侧颈总动脉而不行缺血再灌手术. 从造模术前5 d开始到术后第1，10日，空白对照组和模型组用蒸馏水1 mL灌胃，1次/d,复脑汤组用所配药液按20 g/kg灌胃,1次/d.缺血再灌注第1,10日后，所有的小鼠断头取脑并从大脑纵裂处矢状将大脑分为两半. 右半部分称质量并在冷PBS液中制成脑匀浆. 脑匀浆分别稀释成100,10及1 g/L，以3500 r/min离心15 min，取上清-30℃冰箱保存. 采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，硫代巴比妥酸法（TBA）测定MDA水平. 用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测TNFα及IL1β含量. ELISA试验步骤按试剂说明进行.主要结局：用药后 SOD 活力、MDA水平、TNFα及IL1β含量与未用药组之间的变化比较. 次要结局：模型组SOD活力、MDA水平、TNFα及IL1β含量变化.

   统计学处理：采用统计软件SPSS 13.0进行统计处理，实验结果用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及SNKq检验.P<0.05为有统计学意义.

   2结果

   2.1复脑汤组对脑缺血再灌注小鼠SOD活性及MDA水平的影响与模型组比复脑汤能显著提高SOD的活性(F=16.56,q=3.29,P<0.05)，并降低MDA的水平（表1）.表1各组大鼠脑组织MDA含量和SOD活性的变化

   2.2复脑汤组对脑缺血再灌注小鼠脑内TNFα和IL1β含量的影响与模型组比复脑汤能显著下调小鼠大脑皮质TNFα（F=96.44,q=35.11,P<0.01），IL1β（F=38.30,q=40.92,P<0.01）的水平(表2).表2各组大鼠脑组织TNFα和IL1β的变化

   3讨论

   药研究表明本方中多种药物对实验性动物学习记忆障碍具有不同程度的改善作用［7］. 人参具有益智作用，能促进脑内乙酰胆碱的合成和释放，提高脑内多巴胺和去甲肾上腺素的含量，提高中枢胆碱受体密度，增加脑的能量代谢，促进脑内DNA,RNA和蛋白质的合成;石菖蒲的药理研究表明该药能促进正常小鼠的记忆获得和改善痴呆小鼠的记忆障碍，可能是通过调节机体中枢神经系统机能或保护机体中枢神经功能的完整性、影响中枢递质，改善大脑供血状态或脑代谢状态等多种方式实现的. 淫羊藿能明显增强细胞免疫和体液免疫，提高肝脏总SOD的活性，减少肝脏脂质过氧化物及心、肝组织脂褐素的形成. 水蛭、川芎、葛根具有扩张脑血管，增加脑血流量，降低血液黏稠度，抑制血栓形成作用. 葛根可提高胆碱乙酰转移酶活性，增加大脑皮质及海马乙酰胆碱含量，改善学习记忆功能. 在培养的神经细胞上证实天麻素具有抗自由基、降低LPO、减轻谷氨酸造成的兴奋毒性作用.

   自由基通过诱导生物膜上不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应产生细胞损伤作用. MDA是氧自由基与不饱和脂肪酸脂质过氧化反应的产物. SOD可清除自由基. MDA及SOD的含量变化反映了氧自由基的水平. 可通过检测SOD的活性及MDA的含量判断氧自由基的水平及脂质过氧化反应的程度. 本研究显示,反复脑缺血再灌注后大脑中脂质过氧化水平显著升高，中药组能够通过提高SOD的活性改善这种状态.

   炎性机制在脑缺血再灌注后立刻起作用并能维持一段较长的时间. 在脑缺血后. 缺血激活的内皮细胞和白细胞产生细胞因子和黏附分子. 还有研究表明在脑梗死患者中无论急性期还是恢复期表达均增高，且增高程度与神经功能缺损程度及梗死体积大小密切相关，并认为TNFα,IL1β在神经组织损伤起重要作用［8］. 有研究显示脑缺血后神经组织中的TNFα mRNA,IL1β mRNA表达明显增高，血浆中的TNFα IL1β的含量也明显升高，且TNFα，IL1β可增加兴奋性氨基酸、一氧化氮自由基等神经毒性物质的产生和释放［9］. 运用TNFα，IL1β阻断剂能够减轻脑缺血再灌注后神经元的损伤. 本实验研究表明模型组较空白对照组含量明显升高，说明TNFα，IL1β可在脑缺血再灌注早期表达并发挥生物学效应. 同时本实验显示中药可降低脑缺血再灌注后的TNFα，IL1β含量以及降低MDA的水平，说明中药组可通过阻断脑缺血再灌注后损伤过程中的级联反应而起到神经保护作用.

   【】

   ［1］ Roman GC. Vascular dementia may be the most common form of dementia in the elderly ［J］. Neurol Sci， 2005，202:7-10.

   ［2］ 林海，刘煜，李柱一，等.局灶性脑缺血再灌注后白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的表达及川芎嗪对其表达影响［J］.临床康复，2002，6（7）：968-969.

   ［3］ 徐劲松，王金良，苏涛，等.β七叶皂甙钠与电针联用对脑梗死患者血清TNFα含量的影响［J］.中国临床康复，2002，6（ 11）：1584-1585.

   ［4］ Huang Q, Tatro JB. Alphamelanocyte stimulating hormone suppresses intracerebral tumor necrosis factoralpha and interleukin1 beta gene expression following transient cerebral ischemia in mice ［J］. Neurosci Lett，2003，334(3):186-190.

   ［5］ 刘素蓉，潘斌，成涛.不同治则方药对拟血管性痴呆鼠学习与记忆的作用［J］. 西安大学学报：医学版，2002，23（4）：411-413.

   ［6］ 周文泉，于向东.中医对血管性痴呆的研究概况及思路探讨［J］. 中国临床康复，2003，7（19）：2728-2729.

   ［7］ Black S, Roman GC, Geldmacher DS, et al. Efficacy and tolerability of donepezil in vascular dimaentia: Positive results of 24week,multicentre, international, randomized, placebocontrolled clinical trial ［J］. Stroke，2003，34(10)：2323-2330.

   ［8］ Roman GC, Erkinjuntte T, Walin A, et al. Sbcotical ischaemic vascular dementia ［J］. Lancer Neurol，2002，1(7):426-436.

   ［9］ Tonzani O, Boutin H, Chequel J, et al. Potential mechanisms of interleukn1 involvement in cerebral ischaemia ［J］. Neuroimmunology，2001，100:203-215.