L┐NAME对新生鼠缺氧性脑损伤内源性NO和ET的影响

         作者：王玲，惠延平，侯英萍 ，鱼绥和

【关键词】  L-硝基-精氨酸甲酯

　　关键词: L-硝基-精氨酸甲酯;内皮素;一氧化氮;脑缺氧;新生鼠
    
　　摘 要:目的  用新生大鼠急性缺氧模型，探讨NO合成酶抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯（L-NAME）在缺氧后脑损伤中的作用，进而探讨一氧化氮（NO）和内皮素（ET）在早期缺氧性脑损伤中的作用地位. 方法  检测正常对照组、缺氧组和缺氧前应用L-NAME预处理的新生大鼠血浆ET及脑组织匀浆NO含量及NOS的活性，并观察各组大鼠脑组织病理改变及毛细血管充盈不良程度. 结果  缺氧组血浆ET水平较正常对照组显著升高（P<0.01），而脑NO水平及NOS活性无显著变化（P>0.05），脑毛细血管充盈不良程度与正常对照组相比明显加重（P<0.05）;L-NAME组血浆ET水平较缺氧组显著升高（P<0.05），脑NO含量及NOS活性较缺氧组显著下降（P<0.01），脑毛细血管充盈不良程度与缺氧组相比明显加重（P<0.05）. 结论  急性缺氧早期，ET异常增高是脑损伤的主要因素;此时抑制内源性NO的合成，可加重脑组织的微循环障碍而导致脑缺氧缺血性损害的进一步加重. Effect of L┐NAME on NO and
　　ET in newborn rats with hypoxic brain injuries
       
　　Abstract:AIM To explore the role of nitric oxide（NO）and endothelin（ET）in the early phase of hypoxic brain injuries by examing the effect of Nω -nitro-L-arginine methyl ester（L-NAME），an inhibitor of nitric oxide synthase（NOS），on brain NO production and serum ET level in newborn rats with hypoxic brain injuries.METHODS The rats were di-vided into normal control group，hypoxia group and L-NAME+hypoxia group.The ET level in serum，NO pro-duction，NOS activity，pathology and capillary perfusion in brain were investigated in3groups.RESULTS The serum ET level of hypoxia group was significantly higher than that of controls（P<0.01），but NO production and NOS activity were not significantly different between2groups（P>0.05），and the brain capillary perfusion was more serious in hypoxia group that that in controls.Compared with the hypoxia group，the serum ET level of L-NAME+hypoxia group was increased significantly（P<0.05），NO production and NOS activity in brain was decreased significantly（P<0.01），and brain capillary perfusion was serious significantly（P<0.05）.CONCLUSION Abnormal increase of serum ET in early phase of acute hypoxia is the main factor of brain in-jury;NOS inhibitor L-NAME may make microcirculation dysfunction worse and lead to a further hypoxic-ischemic brain injury.
    
　　0 引言
    
　　一氧化氮（NO）和内皮素（ET）在围产期窒息时两者均升高，但它们在窒息后脑损伤中的作用及应用NO合成酶抑制剂的利弊尚存在争论.我们应用NO合成酶抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯（L-NAME）对围产期窒息动物模型进行预处理，观察缺氧后内源性NO和ET的含量变化及其与脑组织病理和微循环变化的关系，从而探讨两者在早期缺氧性脑损伤中的作用地位及应用L-NAME的利弊.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料 

　　新生10d的SD大鼠（体质量18～24g），由本校实验动物中心提供;L-NAME由Sigma公司生产;ET试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所;NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所;NOS试剂盒购自郑州中亚生物工程公司.

　　1.2 方法
    
　　1.2.1 缺氧动物模型制备［1］   将正常分娩的新生10d的SD大鼠30只随机分为正常对照组、缺氧组及L-NAME组各10只.L-NAME组ip L-NAME3mg kg-1 ，另两组分别ip相同剂量的无菌生理盐水，1h时后将缺氧组及L-NAME组置于有机玻璃缺氧房内，按一定比例输入O2 和N2 ，监控仪控制氧浓度在7%，房内温度24℃，缺氧时间持续1h.4h后各组大鼠断颈取血1mL加入抗凝管，4℃3000r min-1 离心20min，取血浆置-20℃冰箱，用于检测血浆ET水平，然后断头处死动物，立即取出脑组织备用.
    
　　1.2.2 血浆ET浓度检测 

　　采用放射免疫分析法测定，用γ计数检测仪按药盒说明书测定放射活性.

　　1.2.3 脑NOS活性及NO含量测定 

　　将脑组织精确称质量，在冰浴中按质量比1 9加入4℃生理盐水，玻璃匀浆器在冰水中匀浆，然后4℃3000r min-1 离心10min，取上清液用分光光度法测NO含量和NOS活性.NOS活性定义为每分钟克组织蛋白产生1nmol NO为1000个活性单位（×10 3 U g-1  min-1 ）.组织蛋白含量测定用双缩脲法.
    
　　1.2.4 脑组织病理检查 

　　大脑皮层组织标本用40g L-1 甲醛固定、石蜡包埋后，切片，常规HE染色，光镜下观察脑组织病理变化;在脑冠状切面上，对毛细血管充盈不良程度进行分级［2］ :Ⅰ级偶见皮质辐射状毛细血管不充盈;Ⅱ级皮质或（和）皮质下小区域不充盈;Ⅲ级皮质与皮质下交界区不充盈;Ⅳ级皮质下和
    基底神经节广泛灌注不良.    

　　统计学处理:所有数据用x ±s表示，各组数据间的差异，采用F检验;毛细血管充盈不良程度用每一级的例数表示，并用Ridit分析进行比较.
    
　　2 结果
   
　　2.1 大鼠血浆ET及脑NO含量和NOS活性的变化 

　　缺氧组新生大鼠血浆ET水平较正常对照组显著升高（P<0.01），而脑NO含量及NOS活性较正常对照组无显著改变（P>0.05）;L-NAME预处理组，血浆ET水平与缺氧组相比显著升高（P<0.05），脑NO含量及NOS活性较缺氧组显著降低（P<0.05～0.01，Tab1）.表1 各组新生大鼠血浆ET及脑NO含量和NOS活性（略）

　　2.2 脑组织病理改变 

　　正常对照组大鼠脑组织光镜下显示细胞形态结构基本正常;缺氧组光镜下可见脑组织细胞肿胀及间质水肿，并有少许炎细胞浸润，大脑皮层散在点状出血灶;L-NAME组亦表现为脑组织细胞肿胀及间质水肿及大脑皮层散在点状出血灶.各组可见程度不等的毛细血管充盈不良（Fig1，2），各组大鼠脑毛细血管充盈不良程度（Tab2）. 图1 脑皮质毛细血管充盈良好（Ⅰ级）表2 各组大鼠脑毛细血管充盈不良程度的比较（略）

　　3 讨论
    
　　研究证实，脑缺氧缺血急性期血浆、脑脊液和脑组织中ET水平明显升高［3］ ，引起血管收缩使脑血流量明显下降，并直接损伤神经元及胶质细胞参与脑损伤的形成和，ET介导的钙内流是神经细胞死亡的最终途径.本组新生鼠窒息后血浆ET迅速明显升高，NO水平无明显变化，脑组织病理检查可见细胞肿胀及间质水肿和脑微循环障碍，说明窒息早期ET的异常增高是脑损伤的主要因素，与国内Xu等［4］ 报道结果相似.NO在脑缺血缺氧性损伤发病中的作用也引起了广泛的重视.大量研究提示，脑缺氧缺血时NO的增高，主要由神经元型NOS（nNOS）和内皮型NOS（eNOS）介导，它通过NO/cGMP途径使脑血管扩张、增加脑血流，对神经细胞起保护作用［5］ ;而缺氧缺血后期所产生的大量的诱导型NOS（iNOS）及NO的过度释放则起着细胞毒性作用，与脑水肿、脑损伤的发生密切相关［6］ .本组新生鼠缺氧早期NO虽轻度升高，但与正常对照组无明显差异.近年研究发现，ET的缩血管作用较NO的扩血管作用强，而且ET和NO之间有着相互制约的关系.ET和NO之间的动态平衡在缺氧时被打破，两者之间相互作用关系可能是ET增高使细胞内Ca2+ 超载，血管收缩、细胞水肿，同时Ca 2+ 与钙调节蛋白结合，激活NOS，合成NO，而NO增加可以激活鸟苷酸环化酶使细胞内cGMP升高［7，8］ .现已发现内皮细胞内cGMP升高可抑制内皮素的分泌，提示NO可间接地抑制内皮素的分泌［7］ .本实验结果发现，给予NO合成酶抑制剂L-NAME后，虽然脑组织NO合成酶活性及NO含量明显下降，但血浆ET水平明显升高，脑组织病理检查显示脑损伤程度并未减轻，脑微循环障碍加重，表明在急性缺氧早期抑制内源性NO的合成可使ET水平升高，而NO对抗ET缩血管的作用减弱，在一定程度上加重了脑的缺氧缺血状
态.关于NO合酶抑制剂在缺氧缺血性脑损伤中的 作用仍有较多争议.有报道认为，NO抑制剂可减轻缺血缺氧损伤后脑水肿的程度，具有脑组织的保护作用［9］ ;但另有研究表明，NO对于新生大鼠耐受缺氧具有重要作用［10］ ，NO是ET在体内的生物抗衡物质［7］ ，本实验结果亦支持该观点，缺氧早期NO可对抗ET的缩血管作用，在一定程度上改善脑缺氧缺血状态.因此，脑缺氧缺血时应根据不同的时机有选择的应用NO合成酶抑制剂.
   
　　总之，ET和NO在新生儿缺氧缺血性脑病中均起着重要作用，但其在作用中的地位可能存在着一定的时间效应.因此，在HIE的不同阶段应采取适当的方法来调整两者之间的浓度，使之达到平衡，方可减少脑损害.

　　:
    
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