维拉帕米对大鼠肝脏低温保存再灌注损伤的防护机制
【关键词】 肝移植
关键词: 肝移植;维拉帕米;器官保存;再灌注损伤
摘 要:目的 在自制的器官保存液XJ-1液已取得较好结果的基础上，探讨维拉帕米对大鼠肝脏低温保存再灌注损伤的防护作用及其机制. 方法 XJ-1液与XJ-1+维拉帕米液保存大鼠肝脏18h后施行肝脏移植，检测术后血清转氨酶水平、肝组织钙离子及丙二醛含量等指标，观察大鼠术后1wk存活率及移植肝脏的组织病改变. 结果 XJ-1+维液保存的大鼠肝脏移植后4h，血清ALT，AST水平、肝组织钙离子含量、丙二醛含量均显著低于XJ-1液组（P<0.01，P<0.05），光镜与电镜下肝组织形态学改变较XJ-1液组好，同时术后生存状况及1wk存活率也优于XJ-1液（71%vs57%）. 结论 维拉帕米能够减轻肝脏体外保存再灌注损伤，明显增强了XJ-1液对大鼠肝脏的保存效果，原因在于其阻滞钙通道的钙离子拮抗作用.
Protective mechanism of verapamil on rat liver grafts under cold preservation and reperfusion
GAO Chang-Jun ，LI Kai-Zong，GUAN Wen-Xian
1 Department of Anesthesiology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710038，China，2 Department of Hepatobiliary Surgery，Xi-jing Hospital，Fourth Military Medical University
Keywords:liver transplantation;verapamil;organ preserva-tion;reperfusion injury
Abstract:AIM To investigate the protective effect of vera-pamil on rat liver grafts under cold preservation and reperfu-sion and its mechanism on the basis that we had achieved good effects on rat liver preservation using self-designed XJ-1solution.METHODS Rat orthotopic liver transplants were performed with livers preserved for18h in XJ-1solution and XJ-1+V solution.Serum ALT，AST levels and liver tissue concentrations of calcium and malondialdehyde（MDA）were measured.Histological changes of liver were studied.The rats status and1-week survival rates after transplantation were observed.RESULTS The levels of serum ALT，AST，concentrations of Ca2+ and MDA were significantly lower in XJ-1+V solution group than those in XJ-1solution group at4h after transplantation（P<0.01，P<0.05）.Histological-ly，livers of XJ-1+V solution group showed less damage，and1-week survival rate was higher compared with that of XJ-1solution group（71%vs57%）.CONCLUSION Vera-pamil can reduce preservation and reperfusion injury，and im-prove the effects of XJ-1solution on rat liver preservation due to its Ca2+ channel blocking effects.
0 引言
肝移植术后原发性无功能（PNF）是肝移植的主要死亡原因之一，与肝移植体保存-再灌注损伤密切相关［1］ .我们曾自行配制一种新的器官保存液XJ-1液，已成功地用于大鼠心脏的保存，但在保存大鼠肝脏方面逊于UW液［2］ .由于肝脏缺血冷保存过程中钙超载是导致肝细胞损伤的首要途径，我们将钙拮抗剂维拉帕米加入XJ-1液，在大鼠原位肝移植模型中，探讨维拉帕米的防护作用及其机制.
1 材料和方法
1.1 材料
健康雄性Wistar大鼠84只，体质量200～300g，由北京市卫生部生物制品监督局动物实验中心提供，随机分为3组:即XJ-1液保存组、XJ-1+维液保存组和未保存对照组，每组供、受体各14只，7只用来采取标本，7只用来观察移植术后生存状况及1wk存活率.根据经典的Kamada双袖套法并加以改进
［3］ ，施行原位肝移植.液体配制用天平精确称取乳糖酸钠（若干）、棉子糖（若干）、组氨酸（若干）、磷酸二氢钾3.4g，还原型谷光甘肽0.9g，别嘌呤醇0.14g，硫酸镁1.23g，以双蒸水稀释至1000mL，配制成XJ-1液［2］ ;1000mL XJ-1液中加入维拉帕米注射液25mg，即配制成XJ-1+维液.以上液体均经1mol L-1 KOH调定pH值至7.4，2.5μm孔径的滤膜抽滤除菌，置于4℃冰箱保存，1wk内用完，其中肝素钠4000u在保存器官时临时加入.
1.2 方法
供肝切取时以4℃保存液10mL经腹主动脉灌洗肝脏，切取供肝后立即置入盛有0～4℃保存液30mL的小烧杯中行供肝修整，修整完毕加盖置入4℃冰箱保存18h再行肝脏移植，保存时间从切断供肝血供开始.检测:①保存18h后肝组织含水质量分数:（湿质量-干质量）/湿质量×100%，保存液中LDH，AST，ALT等酶学指标的含量;②术后4h重新开腹，从肝静脉抽血2mL，自动血液生化分析仪检测AST，ALT，ALB及胆红素，同时取肝组织标本;③硝酸法测定肝组织中Ca2+ 含量，以μg g-1 （湿质量肝组织）表示.④硫代巴比妥酸法（TBA）测定肝组织氧自由基代谢产物丙二醛（MDA）含量，以nmol g
-1 表示;⑤光镜及电镜下观察肝脏组织病理学的改变;⑥观察动物术后1wk存活率及一般生活状况.
统计学处理:数据资料以x ±s表示，用SPLM软件作方差分析及均数检验，P<0.05为有统计学显著差异.
2 结果
2.1 保存18h后肝组织含水质量分数
正常鼠肝含水质量分数（66.6±0.7）%，XJ-1液与XJ-1+维液保存18h后的肝组织含水（64.7±0.4）%，（65.2±0.9）%，均低于正常（P<0.01），但二者之间无差别（P>0.05）;各组保存液保存鼠肝18h后，均可检测出ALT等酶学指标，但二者之间各项酶学指标的差异均无统计学意义（P>0.05）.
2.2 再灌注后肝功能指标的变化
肝脏保存18h移植后4h，ALT，AST血清水平明显增高，肝组织损伤加重.其中，XJ-1+维液组血清ALT，AST明显低于XJ-1液组（P<0.05），各组血清Alb水平无显著差异，胆红素水平普遍偏高，但无明显（Tab1）.表1 移植术后4h肝功能指标（略）
2.3 肝脏组织中Ca2+ 质量分数
单纯保存的肝脏Ca2+ 质量分数显著低于移植术后的肝脏（P<0.01）;而术后XJ-1+维液组Ca2+ 质量分数明显低于不含钙拮抗剂的XJ-1液组（P<0.01，Tab2）.表2 单纯保存及移植术后肝组织Ca2+ 质量分数（路）
2.4 肝脏组织中丙二醛含量（nmol g-1 ） 再灌注后（术后4h）XJ-1+维液组MDA含量（183±16）显著低于XJ-1液组（220±20）（P<0.05），各组MDA含量均明显高于对照组（128±15）（P<0.05）.
2.5 肝脏组织病改变
单纯保存的肝脏光镜下与保存前比较变化不明显，术后4h，光镜下见XJ-1液组肝小叶结构基本完整，肝板排列有些紊乱，可见脱落的内皮细胞，伴有肝细胞点状坏死，XJ-1+维液组改变比XJ-1液组轻，肝小叶结构尚完整，肝板排列比较整齐，偶见内皮细胞脱落，肝细胞变性坏死少见.电镜水平，术后4h肝脏细胞超微结构的损伤较单纯保存的肝脏严重，XJ-1液组胞质疏松，有较多空泡形成，线粒体肿胀明显，少数呈气球样变，内质网结构轻度改变，核糖体及糖原颗粒减少，胞核结构尚完整，部分内皮细胞变圆脱落，XJ-1+维液组见少量空泡形成，内质网结构正常，线粒体轻度肿胀，偶见气球样变，胞核形态结构亦基本正常，少数内皮细胞变圆脱落.对照组肝脏病理学改变较二者轻.
2.6 移植术后存活状况及1wk存活率
各组动物手术均是同一作者完成，手术操作及各组间供、受体手术、无肝期时间均无差异，术后长期存活的动物，多在术后第2日恢复至术前状态，而短期内死亡的动物，早期恢复尚好，频死前出现眼结膜及消化道出血、摄食减少、毛发蓬松、活动减少，失去警觉性.对照组术后1wk存活率达100%，XJ-1液组1wk存活率为57%（4/7），1只于术后1d死于腹腔出血，另2只于术后2d死于肝功衰竭;XJ-1+维液组1wk存活率为71%（5/7），2只分别于术后2和3d死于腹腔出血和肝功衰竭（Fig1）.
3 讨论
安全有效的器官保存是移植成功的先决条件.理想的器官保存液应能有效地防止低温所致的细胞水肿，灌洗时组织间隙扩张，保存过程中细胞内酸中毒，及再灌注时氧自由基损伤，并能提供合成高能磷酸键所需的底物，Belzer等根据上述原则，结合器官间糖代谢差异的理论，创制了UW液.Jamieson等［4］ 采用UW液首次保存犬肝48h后移植获得成功，随后UW液成功地用于临床肝、胰、肾等多脏器保存.肝移植的飞速，很大程度上要归功于UW液应用于临床.尽管如此，UW液仍有一些不足之处:高渗性引起细胞皱缩，高粘滞性影响原位灌洗，含高钾不符合生理，缓冲体系的缓冲能力较低等，国内外有许多学者对UW液的保存机制及成分作用进行探讨，试图配制出更为有效的保存液，取得了一些成绩.我们曾研制出一种新的细胞外液型保存液XJ-1液，缓冲能力强，粘滞度低，成分简单，价格低廉，不含胶体和钙拮抗剂.研究发现XJ-1液对大鼠离体心脏的保存效果明显优于UW液，而在保存大鼠肝脏方面稍逊于UW液［2］ .
维拉帕米是电压依赖性钙通道阻滞剂，在心、肾、肝等脏器各种缺血模型中都曾被用来有效地防止缺血损伤，促进器官功能恢复［5］ .但这些结果仅是利用肝脏体外灌注模型得到的，并没有做肝脏移植术，观察动物的存活率.本实验中，我们将维拉帕米加入XJ-1液，建立了稳定的大鼠肝脏原位移植模型［3］ ，发现XJ-1+维液保存18h的大鼠肝脏移植后4h，血清ALT，AST水平明显低于XJ-1液组（P<0.05），肝组织钙离子含量较XJ-1液组低（P<0.05），使其维持在
正常水平，同时反应氧自由基损伤的脂质过氧化代谢 产物MDA含量也显著低于XJ-1液组（P<0.05），说明维拉帕米可以显著减轻肝细胞内钙超载，减少氧自由基损伤;在光镜与电镜水平也可观察到XJ-1+维液保存的肝脏优于XJ-1液，XJ-1+维液组肝移植1wk存活率为71%（5/7），高于XJ-1液组（57%，4/7），所以XJ-1+维液对大鼠肝脏的保存效果明显优于XJ-1液.
细胞内钙超载是肝移植体保存再灌注损伤的关键机制之一.肝脏离体保存时，由于缺血乏氧，ATP生成减少，膜电位降低，Na+ -K+ 泵及Ca2+ 泵失活，膜通透性增高，Ca2+ 进入细胞;胞内钙库内质网、线粒体膜上的钙泵亦失活，也会释放大量Ca2+ 进入胞质;而乏氧代谢致酸中毒，胞质内蛋白结合钙以游离Ca2+ 的形式释放出来;再灌注时自由基大量产生，由于其脂质过氧化作用，进一步增加膜的通透性，导致Ca2+ 在胞质内进一步积聚［6］ .本实验中各组保存液均不含有钙离子，经保存液灌洗后的肝脏其脉管系统中钙离子所剩无几，细胞外、组织间隙中未被灌洗液冲出的钙离子内流是缺血保存期间细胞内钙超载的一个来源，实验中还发现单纯保存的肝脏Ca2+ 含量显著低于移植后4h的肝脏，可见再灌注后氧自由基大量生成，进一步损伤胞膜结构，使得血液中的钙离子顺电化学梯度大量内流，胞内钙进一步超载，引起一系列病理生理变化，加重肝组织损伤.
维拉帕米由于其脂溶性而易于进入细胞，不仅在细胞膜上发挥其钙拮抗作用，阻止细胞外、组织间隙的钙离子内流，更为重要的是改善线粒体、内质网等细胞器对缺血乏氧的不良反应，防止细胞内有害的钙离子分配，再灌注期间，进入细胞内的维拉帕米仍可发挥其钙通道阻滞作用，阻滞血液中的钙离子内流入细胞使其免于进一步的钙超载，从而维护细胞的结构与功能，减少保存再灌注损伤.实验中发现XJ-1+维液组的供肝移植恢复血流后，表面呈鲜红色，无花斑状表现，门脉不扩张，肝脏无肿胀，肠管无淤血，各种表现均优于XJ-1液，可见维拉帕米可扩张血管系统，改善微循环，减轻再灌注损伤.
实验结果表明XJ-1液中加入维拉帕米，明显提高了对大鼠肝脏的保存质量，也显示了钙拮抗剂对于大鼠肝脏保存的重要性，为寻求配制更为简单高效的器官保存液奠定了基础.
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