大肠杆菌表达的重组人BMP

【关键词】  重组人骨形成蛋白4成熟肽；重组人骨形成蛋白2成熟肽；发酵；蛋白质类/分离和提纯

　　Comparison of largescale preparation of recombinant human BMP4 and BMP2 mature peptide expressed in E.coli

　　【Abstract】 AIM: To prepare pure human bone morphogenetic protein mature peptide (rhBMP4m and rhBMP2m)in large scale. METHODS: The rhBMP4m and rhBMP2m engineering strains were fermented and induced for expression in 15L NBS fermenter respectively and the bacterial cells were collected by centrifugation. Then the bacterial cells were lyzed and the resulting inclusion bodies were washed for 4 times. After obtaining data from preexperiments, all inclusion  bodies were dissolved in 8 mol/L urea buffer and loaded on SPSepharose FF column. RESULTS: At the end of fermentation, A600 nm values of the two bacterial cultures were 28.8 and 26.3. SDSPAGE analysis showed that rhBMP4m occupied 40% of the total bacterial proteins while that of rhBMP2m was 47.2%. rhBMP4m and rhBMP2m accounted for 82.9% and 84.5% of  the total proteins of the inclusion bodies respectively. After loaded on SPSepharose FF column, rhBMP4m and rhBMP2m were eluted out in 0.35  and 0.20 mol/L NaCl fractions and the purity reached 96% and 95% with the harvest of 1.30  and 1.25 g/L fermentation liquid and the recovery rate were 34.33% and 34.81%, respectively. CONCLUSION:  It could use the same fermentation program and the similar techniques to prepare pure rhBMP4m and rhBMP2m in large scale.

　　【Keywords】  recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide (rhBMP4m);  recombinant human bone morphogenetic protein 2 mature peptide (rhBMP2m);   fermentation; proteins/isolation β purification

　　【摘要】 目的： 大规模制备人骨形成蛋白成熟肽（hBMPm）：hBMP4m和hBMP2m. 方法： 两种工程菌株分别含有能够高表达hBMP4m和hBMP2m的质粒，分别导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达，离心收集菌体, 悬浮所收集的菌体，裂菌，洗涤4次. 预先取少量样品进行探索实验后，全部包涵体分别用8 mol/L尿素缓冲液溶解，上Sepharose SPFF阳离子柱. 结果： 发酵菌液A600 nm值分别为28.8和26.3. SOSPAGE电泳后吸光度扫描表明hBMP4m占细菌总蛋白量的40.0%, hBMP2m占细菌总蛋白量的47.2%. 洗涤4次后的包涵体中hBMP4m占蛋白量的82.9%, hBMP2m占蛋白量的84.5%. 上Sepharose SPFF阳离子柱后，分别收集0.35 mol/L NaCl和0.20 mol/L NaCl洗脱部分，获得纯度为96%的hBMP4m及纯度为95%的hBMP2m. 其收获量分别为1.30 g/L发酵液和1.25 g/L发酵液；收得率分别为34.33％和34.81％. 结论： 大规模制备hBMP4m和hBMP2m时，使用相同的发酵程序及相近的纯化方法，都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度.
 
　　【关键词】  重组人骨形成蛋白4成熟肽；重组人骨形成蛋白2成熟肽；发酵；蛋白质类/分离和提纯

　　0引言

　　骨形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）属于转化生长因子TGFβ超家族，是一类多功能的分化因子，构成一个结构和功能相似的家族，由于可以诱导异位成骨而被命名，是骨骼系统正常发育所必不可少的［1］. 而近年来的研究表明，BMPs在胚胎发生、神经系统发育及造血系统等方面也具有重要作用和广泛的临床应用前景［2-3］. 我们在大肠杆菌系统表达制备出有良好诱导成骨活性的人rhBMP2成熟肽（rhBMP2 mature peptide, rhBMP2m）［4-5］和用大肠杆菌系统表达制备有良好生物学活性的rhBMP4m［6］（国家专利申请号：200410073165.8）的基础上，使用已经构建好的高表达rhBMP4m和rhBMP2m的大肠杆菌工程菌株［4-6］，用已比较成熟的制备rhBMP2m的流程，来比较两者大规模发酵、纯化的效果，旨在为rhBMP4m的大规模生产奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料工程菌株DH5α/pDH2BMP4m和DH5α/pDH2BMP2m由第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室构建并保存. 15 L全自动发酵罐购自美国NBS公司；Monitor UV1和 阳离子交换剂SPSepharose FF购自美国Pharmacia公司；玻璃层析柱购自上海锦华玻璃仪器厂，填料自装. 透析膜（截留分子量10 000）购自洛阳华美公司；超声细胞粉碎仪JY983购自宁波新芝科仪研究所；低温高速离心机购自湖南湘西仪器仪表厂. 溶菌酶，DNAaseⅠ购自美国 Invitrogen；去氧胆酸钠购自上海伯奥生物科技有限公司；TritonX为美国FARCO CHEMICAL产品；氯化镁，氯化钠，醋酸钠磷酸氢钠，磷酸二氢钠，尿素均为化学分析纯，购自天津化学试剂六厂和沈阳化学试剂厂；Brandfod蛋白定量试剂为本实验室配制；低分子量蛋白markers购自上海生化所.
 
　　1.2方法

　　1.2.1rhBMP4m及rhBMP2m的高密度发酵取-70℃保存的DH5α/pDH2hB4m及DH5α/pDH2BMP2m工程菌株甘油菌种，划LB琼脂平板(含100 μg Amp /mL)，32℃培养20 h. 分别挑单菌落入6 mL LB（含100 μg Amp /mL）， 30℃摇床培养16 h. 转入300 mL LB(含100 μg Amp /mL)，30℃摇床培养10 h. 转入15升发酵罐30℃培养，开启NBS数模转换器并连接机，由注入口向发酵罐内注入300 mL菌种（此步保持无菌操作），接装碱泵，启动自动控制程序，设定30℃生长16 h，自动恒定控制氧溶量，自动流加16.5 mol/L氨水使pH值保持在7.0左右，搅拌速度在200～800转间受溶解氧的反馈调控，空气流速8 L/min，由溶解氧控制分批补料的培养. 生长16 h后取样观察发酵液密度，再升温42℃诱导培养4 h后，结束发酵.
 
　　1.2.2裂菌、包涵体洗涤按每克湿菌加入3 mL裂解缓冲液(蔗糖100 g/L,  pH 8.0 TrisHCl 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L),洗涤液，彻底分散菌体，充分悬浮后，加溶菌酶3 mg/克湿菌，充分搅拌融解；加入0.1 mmol/L去氧胆酸钠充分搅匀，最后加入5 mg/mL DNasel搅匀，室温放置至黏度降低，4℃离心13.4 g，15 min，收取沉淀. 按每克湿沉淀加入3 mL洗涤液（TritonX100 5 g/L， pH 8.0 TrisHCl 10 mmol/L, EDTA1 mmol/L），彻底分散，充分悬浮，于冰浴中超声裂菌，4℃离心5.9 g，10 min，收取沉淀. 再重复上述操作，共洗涤4次，最后收集蛋白沉淀.
 
　　1.2.3层析预实验取少量洗涤后的包涵体溶于8 mol/L尿素pH 6.5上样缓冲液(8 mol/L尿素，20 mmol/L磷酸钠缓冲液pH 6.5， 0.018 mmol/Lβ巯基乙醇)中，上自行安装的小Sepharose SPFF柱，以含0~1 mol/L NaCl的上样缓冲液作连续线性梯度洗脱，收集不同盐浓度的洗脱蛋白峰进行电泳分析，探索得洗脱出目的蛋白时的NaCl浓度.