结核分枝杆菌Ag85B/IL

【关键词】  Ag85B；IL

　　Prokaryotic expression, purification and identification of Mycobacterium tuberculosis Ag85B/IL2 fusion protein and detection of its biological activity

　　【Abstract】 AIM： To express Mycobacterium tuberculosis Ag85B/ IL2 fusion protein in E.coli, to purify and identify it, and to detect its biological activity. METHODS： By using  genetic engineering techniques, we constructed a recombinant expression plasmid pGEXAg85B/IL2, and expressed Ag85B/IL2GST fusion protein in E.coli BL21 under the induction of IPTG. Moreover, we also studied the optimal expression conditions concerning IPTG concentration and induction time. After renatured by urea in a concentration gradient, and purified by GSTSepharose affinity chromatography and digested by thrombin, the Ag85B/IL2 fusion protein was further purified by anionexchange chromatography and RPHPLC and identified with Western blot. Its Nterminal amino acid sequence and  IL2 bioactivity were measured as well. RESULTS： A novel fusion protein Ag85B/IL2GST was expressed in E.coli in a way of inclusion body,accounting for  30% of total lysate protein of bacteria. After purified by GSTSepharose affinity chromatography, anionexchange chromatography and RPHPLC, the desired Ag85B/IL2 fusion protein with purification degree of 98.32% was acquired and confirmed by Western blot. Its Nterminal amino acid sequence was identical to the anticipation, and its specific IL2 bioactivity was 2500 u/mg. CONCLUSION： Ag85B/IL2 fusion protein was successfully expressed in E.coli and purified. This results established a groundwork for the further researches of Ag85B/IL2 fusion protein in the immunotherapy of bladder tumor.

　　【Keywords】 Ag85B; interleukin2; prokaryotic expression; fusion protein; purification

　　【摘要】 目的：在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B/IL2融合蛋白，并对其进行纯化、鉴定和活性初步测定. 方法：将构建的pGEXAg85B/IL2重组菌BL21扩增后接种于LB培养基中，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达，筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间；梯度浓度尿素复性包涵体，经GSTSepharose亲和层析、凝血酶切、阴离子交换层析和反相高效液相（RPHPLC）层析纯化Ag85B/IL2融合蛋白，免疫印迹（Western blot）鉴定，并测定其N末端氨基酸序列和IL2比活性. 结果：成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的Ag85B/IL2融合蛋白，占菌体总蛋白的30％，主要以包涵体形式表达，于诱导后6 h表达量达最高峰. 对包涵体复性，纯化获得纯度为98.32％的Ag85B/IL2融合蛋白，Western blot鉴定阳性，N末端氨基酸测序与理论预期完全一致，IL2比活性为2500 u/mg. 结论：高效表达并纯化了Ag85B/IL2融合蛋白，为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫中的作用奠定了基础.

　　【关键词】 Ag85B；IL2；原核表达；融合蛋白；纯化

　　0引言

　　膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，具有发病率高、复发率高、治疗难度大等临床特点. 卡介苗（BCG）膀胱灌注是治疗表浅型膀胱肿瘤及预防其复发最有效的方法之一，BCG联合白介素2（IL2）治疗膀胱肿瘤具有更好的临床疗效［1-2］. 但无论是BCG还是IL－2在临床治疗膀胱癌均存在着剂量大、疗程长、毒副作用大等缺点. Ag85B是BCG、结核杆菌及其他分枝杆菌最主要的分泌蛋白［3］，也是BCG在体外和体内发挥生物学作用的主要成分，能够诱导机体强烈的Th1免疫反应［4-5］. 利用分枝杆菌Ag85B的免疫原性，在膀胱肿瘤免疫治疗中的应用近年引起人们关注［6-7］. 为了探寻新的免疫治疗膀胱肿瘤的药物，我们前期利用基因工程技术，将结核分枝杆菌Ag85B与人IL2融合，成功构建了Ag85B/IL2融合蛋白的表达质粒，为了进一步研究该融合蛋白体内外生物学活性，我们对其进行了原核表达、纯化和活性的初步测定.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　重组菌大肠杆菌BL21/pGEXAg85B/IL2由本室构建，其表达产物带有GST标签. AkTA Explore 100中高压层析系统、GSTSepharose 4B层析柱、Q Sepharose Fast Flow柱、Resource RPC层析柱均为瑞典Pharmacia公司产品. 凝血酶为Sigma公司产品. CTLL2细胞株、重组hIL2标准品来源于第三军医大学免疫学教研室. 兔抗结核分枝杆菌Ag85B多克隆抗体由本室张勇制备［8］. 常规试剂为分析纯.

　　1.2GSTAg85B/IL2融合蛋白的表达挑取重组菌BL21/pGEXAg85B/IL2单菌落接种于含100 μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中，经37℃过夜活化，以1∶50稀释转种于100 mL含Amp的LB中，继续振荡培养至A600 nm为0.6时，加入不同浓度异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),37℃诱导培养，筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间，然后进行扩大培养表达. SDSPAGE分析表达产物.

　　1.3GSTAg85B/IL2融合蛋白的复性收集1 L诱导表达的工程菌体，用Buffer A(50 mmol/L TrisHCl,pH 8.0；1 mmol/L EDTA；2 mmol/L DTT；0.1 mmol/L PMSF)重悬，加入1 g溶菌酶，冻溶3次，冰浴中超声破菌， 4℃ 8000 r/min离心20 min，收集沉淀. 用2 mol/L尿素反复洗涤包涵体后，溶于变性液（8 mol/L尿素，2 mmol/L β巯基乙醇，10 mmol/L PBS  pH 7.5）, 以磁力搅拌器轻柔搅拌，放置于4℃冰箱溶解过夜（12 h）， 次日以15000 r/min 离心20 min，吸取上清，装入透析袋以4 mol/L尿素，2 mol/L尿素，1 mol/L尿素，和20 mmol/L PBS(pH 7.5)逐步透析，透析完成后收集透析袋中蛋白溶液，浓缩后-20℃贮存备用.

　　1.4Ag85B/IL2融合蛋白的纯化

　　1.4.1GSTSepharose亲和层析及凝血酶切层析柱为XK 2b，柱床体积50 mL. 样品流速10 mL/min，10 mmol/L谷胱甘肽GSH溶液洗脱，收集蛋白峰. 将重组蛋白样品用10 mmol/L PBS (pH 7.5)稀释至1 mg/mL，每mL样品溶液中加入凝血酶0.2 u混匀，室温下作用5 h. 取20 μL样品行SDSPAGE，分析酶解率.

　　1.4.2阴离子交换层析采用5 mL Q Sepharase Fast Flow柱对凝血酶切后的融合蛋白进一步纯化. 用缓冲液A（10 mmol/L  PBS pH 7.5）平衡柱后上样，流速2.5 mL/min. 先以0~100％缓冲液B（1 mol/L NaCl+10 mmol/L PBS pH 7.5）连续浓度梯度洗脱以确定最适洗脱条件，再行NaCl分步洗脱，收集280 nm紫外吸收峰样品, 取20 μL样品行SDSPAGE分析纯度.

　　1.4.3反相

　　高效液相（RPHPLC）层析选用3  mL Resource  RPC反相柱对离子交换层析后的融合蛋白进一步纯化. 先用缓冲液A（100 mL/L三氟乙酸 TFA）平衡柱子，离子交换层析后的样品稀释5倍后上柱，流速1 mL/min. 在10倍柱床体积内用0%~60％缓冲液B（乙腈+1 g/L TFA）连续浓度梯度洗脱，收集蛋白主峰. SDSPAGE和RPHPLC分析融合蛋白纯度.

　　1.5免疫印迹鉴定纯化产物按常规进行SDSPAGE，PVDF膜电转印、30 g/L牛血清白蛋白（BSA）封闭2 h，并依次加入兔抗Ag85B多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG(1∶2000)各孵育2 h，OPDH2O显色.

　　1.6Ag85B/IL2融合蛋白N末端氨基酸测序将纯化的目的蛋白行SDSPAGE，电转印至PVDF膜，进行N末端氨基酸序列测定，由北京大学生命院完成.

　　1.7Ag85B/IL2融合蛋白IL2比活性的测定利用IL2依赖性细胞株CTTL2细胞，测定Ag85B/IL2融合蛋白中IL2比活性（MTT法）.
样品的IL2活性(U/mL)=(待测样品A值最大值的50%所需稀释度/标准品A值最大值的50%所需稀释度)×标准品活性(U/mL).

　　2结果

　　2.1融合蛋白的表达SDSPAGE结果显示，在分子量(Mr)约66 000处出现了一条新的蛋白，与带有GST蛋白标签的Ag85B/IL2融合蛋白（Ag85B/IL2GST）理论大小相符，薄层扫描分析融合蛋白占菌体总蛋白的30％，主要以不可溶的包涵体形式表达（图1）. 采用0.05， 0.1， 0.5和1.0 mmol/L四种浓度的IPTG诱导表达，表达量无明显差异；各浓度组均以诱导6 h时表达量达到最高峰（图2）.

　　2.2融合蛋白的复性和纯化经不同浓度的尿素透析复性后的融合蛋白呈可溶澄清状. 上样行GSTSepharose亲和层析，收集洗脱蛋白峰，SDSPAGE表明纯度为70％左右,可能有部分杂蛋白发生了非特异性吸附. 对其行凝血酶切后，显示出Mr约66 000，45 000和26 000三条主要蛋白条带（图3），根据分子量大小判定分别为未切开的GSTAg85B/IL2，切开后的Ag85B/IL2和GST，中间45 000左右蛋白条带与Ag85B/IL2融合蛋白理论大小相符，因此是我们需要进一步纯化的目的蛋白. 进一步行离子交换层析，去除了大量杂蛋白，目的蛋白纯度达85％. 经反相高效液相层析（RPHPLC）柱后，纯度进一步提高，SDSPAGE行薄层凝胶扫描纯度大于95％（图3）；RPHPLC鉴定，用峰面积，目的蛋白纯度为98.32％.

　　M: 低分子蛋白Marker; 1: IPTG诱导后的重组菌BL21/pGEXAg85B/IL2裂解产物; 2: 未诱导的重组菌BL21/pGEXAg85B/IL2裂解产物; 3: IPTG诱导后的重组菌BL21/pGEX4T1裂解产物; 4: 未诱导的重组菌BL21/pGEX4T1裂解产物; 5: IPTG诱导后的BL21裂解产物; 6: 未诱导的BL21裂解产物; 7: IPTG诱导后的重组菌BL21/pGEXAg85B/IL2裂解产物沉淀.

　　2.3Western blot鉴定结果将纯化的蛋白行SDSPAGE电泳并转移至PVDF膜，用兔抗Ag85B多克隆抗体进行免疫鉴定，结果呈现清晰的阳性反应条带，间接证实纯化的蛋白即为预期的Ag85B/IL2融合蛋白（图4）.

　　2.3融合蛋白N末端氨基酸测序共测了N末端10个氨基酸，序列为GlySerProGluPheMetPheSerArgPro(GSPEFMFSRP)，与理论预测的Ag85B/IL2融合蛋白N末端氨基酸序列完全一致.
2.4融合蛋白IL2比活性的测定用IL2依赖性细胞株CTTL2细胞测得Ag85B/IL2融合蛋白IL2比活性为2500 U/mg.

　　3讨论

　　Ag85B又称为αAg或MPB59，是BCG，结核杆菌及其他分枝杆菌最主要的分泌蛋白. Ag85B结构基因长855 bp，编码285个氨基酸残基，分子量约30 000［2］. Ag85B能够促进膀胱癌患者外周血单个核细胞（PBMC）的增殖，且这种作用高于BCG，热休克蛋白65(HSP65)等，并能诱导Th1细胞分泌IFNγ和IL12等细胞因子［6］. 利用转染Ag85B基因的膀胱肿瘤细胞疫苗免疫动物后，抗原递呈细胞（APC）分别通过MHCⅠ类和Ⅱ类分子，既能递呈CTL表位肽，又能递呈Th表位肽，从而比其他的基因修饰的肿瘤细胞疫苗具有更大的抗肿瘤优势［7］.

　　为了探寻新的免疫膀胱肿瘤的药物，我们利用基因工程技术，将结核分枝杆菌Ag85B与人IL2融合，成功构建Ag85B/IL2融合基因及其原核表达载体，期望通过原核表达获得Ag85B/IL2融合蛋白，并进一步研究其在体内外对膀胱肿瘤的生物学作用. 理论预测Ag85B/IL2融合蛋白可能在运用于膀胱肿瘤的治疗时具有以下优势：① Ag85B能诱导机体的Th1型免疫反应，IL2能够激活T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞，两者融合后可能发挥免疫协同作用，达到类似于联合应用BCG和IL2时的效果；② 作为一种蛋白物质，具备BCG样的免疫原性，但又避免了BCG活菌疫苗的毒副作用；③Ag85B具有与膀胱壁纤维粘连蛋白（FN）结合的特性［9-10］，从而靶向性的引导该融合蛋白粘附于膀胱壁，延长作用时间；④可能会减少与剂量相关的副作用.

　　本研究利用前期构建的表达质粒pGEXAg85B/IL2，在大肠杆菌中成功高效表达出有GST的Ag85B/IL2融合蛋白（GSTAg85B/IL2），该融合蛋白是以不可溶的包涵体形式存在的. 经尿素逐级透析复性后的融合蛋白经GSTSepharose柱进行亲和层析，纯度达到70%，可能在过亲和层析柱时，有部分杂蛋白同时发生了非特异性吸附. 由于GST与Ag85B/IL2之间有可被凝血酶切割的氨基酸序列（Leu Val Pro Arg Gly Ser），因此通过凝血酶可将融合蛋白中的GST切下. 用凝血酶酶切亲和层析产物，SDSPAGE出现了三条主要蛋白条带：根据分子量大小分析应该为未切开的GSTAg85B/IL2, Ag85B/IL2和GST三种蛋白. 对酶切产物进行了阴离子交换层析，使Ag85B/IL2融合蛋白的纯度达到85％；进一步经RPHPLC层析后，纯度上升为98.32％，达到蛋白质测序和生物活性测定要求.

　　纯化的融合蛋白用兔抗Ag85B多克隆抗体进行免疫鉴定，结果呈现清晰的阳性反应条带，间接证实纯化的蛋白为预期的Ag85B/IL2融合蛋白. 同时N末端氨基酸测序与理论预测的Ag85B/IL2融合蛋白N末端氨基酸序列完全一致，表明在表达及纯化过程中，融合蛋白没有发生变异. 用CTTL2细胞株测得Ag85B/IL2融合蛋白具有IL2活性，初步说明在复性过程中，蛋白质可能正确折叠，恢复其天然构象，从而保持了天然活性. 这为我们进一步研究Ag85B/IL2融合蛋白在体内外对膀胱肿瘤的治疗效应奠定了坚实的基础.

　　【】

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