复合预处理对大鼠肠缺血再灌注的保护作用

【关键词】  小肠

　　Protective effect of compound preconditioning  on small  intestine from ischemiareperfusion injury in rats

　　【Abstract】 AIM:  To investigate the protective effect of compound precondition(ischemicpreconditioning under the mild hypothermia MHIP) on small intestine from   ischemiareperfusion(I/R) injury in rats and its mechanism. METHODS: Thirtytwo  rats were randomized into 4  groups (8  in each group): Sham operated group (sham), ischemiareperfusion (I/R) group, ischemicpreconditioning (IP) group, mild hypothermia ischemicpreconditioning (MHIP) group.The wet/dry ratio, Ca2+Mg2+ATPase in intestine tissue, the LDH, malondialdehyde (MDA), and activities of superoxide dismutase (SOD) and total antioxidase (TAX) in blood were compared.  ultrastructure, Bcl2 and Bax expression in intestinal mucosa tissue were observed. RESULTS: After I/R, the tissue wet/dry ratio, LDH and MDA were significantly elevated（P<0.01）.  Ca2+Mg2+ATPase, SOD, TAX declined obviously;  the optic density  of Bcl2 and Bax proteins increased significantly（P<0.01）. The tissue wet/dry ratio, LDH, MDA and the optic density  of Bax protein were significantly lower in IP group than  in I/R group, and in MHIP group than  in IP group. The content of Ca2+Mg2+ATPase.  SOD, TAX and the optic  density  of Bcl2 protein were significantly higher in IP group than  in I/R group (P<0.01),  and in MHIP group than  in IP group （P<0.05）.CONCLUSION:  MHIP can protect intestine against I/R injury in rats, which may be related to enhancing oxidationresistance of intestine, inhibiting lipid peroxidation, upregulating the protein expression of  bcl2 genes and downregulating the protein expression of  bax genes and reducing myocyte apoptosis.

　　【Keywords】 intestine, small;   reperfusion; mild hypothermia; ischemicpreconditioning; gene expression

　　【摘要】 目的： 探讨复合预处理（亚低温下缺血预处理）对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用及机制. 方法： 将32只大鼠随机分为4组（每组8只）：假手术对照组（Sham）、缺血再灌注组（I/R）、缺血预处理组（IP）、亚低温预处理组（MHIP）.  比较各组小肠组织湿干质量比、Ca2+Mg2+ATP酶含量及血清乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活力、总抗氧化（TAX）能力的变化，并观察各组肠组织超微结构及Bcl2, Bax蛋白表达. 结果: 肠缺血再灌注后小肠湿干质量比值增高,LDH, MDA含量明显上升（P<0.01），Ca2+Mg2+ATP酶、SOD活性及TAX能力明显下降，小肠组织Bcl2和Bax蛋白表达吸光度（A）明显增高（P<0.01）；IP组与I/R组比较及MHIP组与IP组比较小肠湿干质量比值减小，LDH，MDA含量明显下降，Ca2+Mg2+ATP酶、SOD活性及TAX能力明显上升，小肠组织Bcl2蛋白表达吸光度（A）值增高，Bax蛋白表达吸光度（A）值降低（P<0.01, P<0.05），Bcl2/Bax吸光度（A）比值明显增高. 结论： 亚低温缺血预处理通过增加肠组织自身抗氧化能力、抑制脂质过氧化、上调Bcl2基因的蛋白表达与下调Bax基因的蛋白表达以抑制肠组织细胞凋亡的发生等机制对抗肠缺血再灌注损伤.

　　【关键词】 小肠；再灌注；亚低温；缺血预处理；基因表达

　　0引言
  
　　亚低温对脑和肝缺血再灌注损伤有保护作用［1,2］，但亚低温缺血预处理对小肠缺血再灌注损伤作用的研究尚未见报道. 我们在缺血预处理和亚低温研究的基础上，应用大鼠小肠缺血再灌注损伤模型，观察亚低温缺血预处理对肠缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其可能的机制.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　1.1.1动物选用Wistar健康雄性大鼠32只，体质量230~280 g. 由咸宁医学院动物室提供. 将32只大鼠随机分为4组，每组8只. ① 假手术对照组（Sham）：仅暴露肠系膜上动脉（SMA）而不夹闭，共2  h结束实验后取材；② 缺血灌注组（Ischemiareperfusion, I/R）：夹闭SMA 60 min后松夹60 min再取材；③ 缺血预处理组（Ischemicpreconditioning, IP）：夹闭SMA 5 min和松夹5 min作为预处理，余同I/R组；④ 亚低温预处理组（mild hypothermia ischemicpreconditioning, MHIP）：在实施缺血预处理前在小肠周围充填碎冰造成小肠亚低温（33~35℃）［3］，余同IP组.

　　1.1.2药品及试剂乳酸脱氢酶（LDH）、Ca2+Mg2+ATP酶含量、总抗氧化（TAX）能力、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，Bcl2, Bax免疫试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，其他试剂均为国产分析纯. 结果测定按试剂盒提供的说明书严格进行操作.

　　1.2方法

　　1.2.1模型制备100 mL・L-1水合氯醛（3.5 mL・kg-1, ip）麻醉后，仰卧固定，取腹部正中切口，暴露SMA,用无损伤动脉夹夹闭其根部导致缺血，松夹即为再灌注，在各设定时相点经髂动脉取血并迅速放血致死，同时取中段小肠匀浆.

　　1.2.2指标测定① 取定量肠组织制备组织匀浆测定Ca2+Mg2+ATP酶活性，并留取肠组织观察组织湿干质量比值；经髂动脉取血分离血浆，测定LDH活性，SOD, MDA含量，TAX能力；②冰冻切片后，用免疫组化方法，通过DAB显色，观察bcl2 及 bax 蛋白表达，在显微镜下用图像分析系统检测吸光度（A）值（每组选10个视野分别测量，均值）；③冰冻切片后，光镜下观察并拍片，根据Chiu肠粘膜损伤进行分级，电镜标本严格制片，在日立H600透视电镜下观察并拍片.

　　统计学处理：所有数据均以 x±s表示，组与组之间采用t检验.

　　2结果

　　2.14组动物小肠组织湿干质量比Ca2+Mg2+ATP酶含量以及血浆TAX, LDH, SOD, MDA的变化肠缺血再灌注后小肠湿干质量比值增高,LDH, MDA含量明显上升（P<0.01），Ca2+Mg2+ATP酶、SOD活性及TAX能力明显下降（P<0.01）；缺血预处理组与缺血再灌注组比较及亚低温预处理组与缺血预处理组比较小肠湿干质量比值减小，LDH， MDA含量明显下降（P<0.01, P<0.05）， Ca2+Mg2+ATP酶、SOD活性及TAX能力明显上升（P<0.01, P<0.05, Tab1) .

　　表1大鼠肠组织湿干质量比、Ca2+Mg2+ATP酶含量、血浆TAX， LDH， SOD活性及MDA含量　(略)

　　2.24组动物小肠组织Bcl2, Bax和Bcl2/Bax蛋白表达吸光度（A）值的变化肠缺血再灌注后小肠组织Bcl2和Bax蛋白表达吸光度（A）值明显增高，与假手术对照组有显著性差异（P<0.01）；缺血预处理组与缺血再灌注组比较及亚低温预处理组与缺血预处理组比较小肠组织Bcl2蛋白表达吸光度（A）值增高（P<0.01, P<0.05），Bax蛋白表达吸光度（A）值降低（P<0.01, P<0.05），Bcl2/Bax吸光度（A）比值明显增高 （Tab 2 ）.

　　2.34组动物肠组织学改变光镜下，将各组肠粘膜损伤进行比较：假手术对照组肠粘膜基本正常，损伤均为0级；缺血再灌注组肠粘膜损伤（Ⅱ级2只，Ⅲ级3只，Ⅳ级3 只）明显高于假手术对照组（P<0.01）；缺血预处理组肠粘膜损伤（Ⅰ级2只，Ⅱ级4只，Ⅲ级2只）明显低于缺血再灌注组（P<0.01）；亚低温预处理组肠粘膜损伤（0级1只，Ⅰ级3只，Ⅱ级4只）低于缺血预处理组（P<0.05）. 电镜下，假手术对照组肠粘膜上皮微绒毛排列整齐，各细胞器形态正常；I/R组肠粘膜上皮微绒毛稀疏、变短、脱落，线粒体明显肿胀，空泡变性，内质网排列紊乱、肿胀；缺血预处理组肠粘膜上皮微绒毛排列基本整齐，线粒体内质网轻度肿胀；而亚低温预处理组肠粘膜上皮微绒毛排列整齐，线粒体内质网肿胀不明显.

　　表24组小肠组织Bcl2、 Bax和Bcl2/Bax蛋白表达吸光度（A）值的比较　(略)

　　3讨论

　　1986年Murry等［4］提出预处理(preconditioning, PC)这一概念，他们在动物实验中，发现心脏经历多次短暂缺血后，紧接一个较长时程的心肌缺血，不仅没有“累积性损伤”，而且心肌对随后较长时间缺血产生更大的耐受力，这一现象称为缺血预处理的保护作用. 近年来，IP对脑、肾、肝I/R损伤的保护作用已有大量报道，并从内源性细胞保护物质、膜受体信息传递及细胞代谢因素等方面探讨其保护机制. IP对组织的保护作用毕竟有限，目前有研究表明，亚低温对脑［5］、肝［3］I/R所致氧自由基损害有保护作用. 我们在大鼠小肠I/R损伤模型上观察亚低温对IP的增强效应和亚低温缺血预处理即复合预处理对小肠I/R损伤的保护作用. 实验结果显示，I/R组肠组织湿干质量比值、LDH, MDA含量明显上升，Ca2+Mg2+ATP酶、SOD活性及TAX能力明显下降，表明肠I/R后，产生大量的氧自由基，作用于生物膜发生脂质过氧化，造成组织细胞损害. IP组肠组织湿干质量比值、LDH, MDA含量明显低于I/R组，Ca2+Mg2+ATP酶、SOD活性及TAX能力明显高于I/R组. 表明IP能提高小肠组织的抗氧化能力，抑制肠组织脂质过氧化反应，减轻I/R产生氧自由基所致的损伤. 但IP只能减轻不能避免这种损伤，限制了临床应用. 本实验在IP前对小肠实施亚低温处理，以期增强IP的保护作用. 实验结果显示，MHIP组与IP组比较，小肠湿干质量比值减小，LDH, MDA含量明显下降，Ca2+Mg2+ATP酶、SOD活性及TAX能明显上升，肠粘膜损伤程度及肠组织超微结构异常也明显减轻. 提示亚低温能增强IP的保护作用. 其机制可能是亚低温进一步抑制小肠因I/R所致的肠组织脂质过氧化反应，提高小肠的抗氧化能力，减轻氧自由基所致的损害，维护细胞的正常能量代谢及细胞器形态和功能的完整性.

　　我们发现，肠I/R后，小肠组织Bcl2和Bax蛋白表达吸光度值明显增高，与对照组有显著性差异；MHIP组小肠组织Bcl2蛋白表达吸光度值明显高于I/R组，Bax蛋白表达吸光度明显低于I/R组，Bcl2/Bax吸光度值比值也明显高于I/R组. Bcl2是一种细胞凋亡的抑制基因，Bax是一种细胞凋亡的促进基因，二者相互作用调控细胞凋亡［6,7］. 我们认为MHIP对抗I/R损伤的机制可能是诱导了Bcl2的表达，抑制了Bax的表达，从而抑制肠组织细胞凋亡的启动，减轻肠I/R损伤. 本实验结果的意义就是在基因水平上观察到复合预处理对肠移植的供体小肠血供复流时的再灌注损伤保护作用，为临床应用提供有效方法和理论依据.

　　【】

　　［1］ Zhao H, Asai S, Kohno T, Ishikawa K. Effects of brain temperature on CBF thresholds for extra cellular glutamate release and reuptake in the striatum in a rat model of global ischemia ［J］. Neuroreport, 1998;9(14):3183-3188.

　　［2］ Wang CY, Li Y, He HP, Fu L, Liu Y. Role of mild hypothermia in ischemia and reperfusion injure in rabbit liver［J］. Zhonghua Shiyan Waike Zazhi (Chin J Exp Surg), 2002;19(3):254-255.

　　［3］ He JS, Jiang LH, Yang X, Lu XS, Xu MQ, Lai JJ, Yang XQ. Protective effect of mild hypothermia on liver injury of hepatic ischemiareperfusion ［J］. Zhongguo Putong Waike Zazhi (Chin J Gen Surg), 2000;9(2):132-134.

　　［4］ Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium ［J］. Circulation,1986; 74(5):1124-1136.

　　［5］ Ge CL, Tan XZ, Cai HW, Li YQ, Shu QM, Lei BP. Effect of  mild hypothermia on the content of malondialdehyde (MDA) and activities of superoxide dismutase (SOD) in brain tissue after complete cerebral ischemia reperfusion in dogs ［J］. Zhonghua Chuangshang Zazhi (Chin J Traumatol), 1997;13(1):1012.

　　［6］ Misao J, Hayakawa Y, Ohno M, Kato S, Fujiwara T, Fujiwara H.Expression of bcl2 protein, an inhibitor of apoptosis, and Bax, an accelerator of apoptosis, in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction ［J］.Circulation,1996;94(7):1506-1512.

　　［7］ Freude B, Masters TN, Kostin S, Robicsek F, Schaper J. Cardiomyocyte apoptosis in acute and chronic conditions ［J］. Basic Res Cardiol, 1998;93(2):85-89.