可吸收性材料CPP生物安全性评价

           作者：杨团民，张庆华，薛金山，贺增良，李毅，焦宁，张文

【关键词】  聚磷酸钙纤维；可吸收性植入物；毒；安全性

　　Biological security evaluation of an absorbable CPP material

　　　【Abstract】 AIM: To evaluate the biological security of a new kind of absorbable CPP material used for internal fixation of fracture. METHODS: Maximal tolerant dose of CPP was determined by intraperitoneal (ip) injection of its extractives to mice, and micronucleus test of bone marrow cells, spermatic aberration test, chromosomal aberration test, and teratogenic test were done by ip injection of maximal tolerant dose of CPP to evaluate its biological security. CPP intramuscular implantation was performed to observe its surrounding tissue reaction and evaluate its biological compatibility. RESULTS: Maximal tolerant dose of CPP extractives was above 40 mL/kg, and this dose did not have any obvious effects on micronucleus rate of bone marrow cells (1.36±0.27)‰, chromosomal aberration rate (1.94±0.46)%, spermatic aberration rate (1.51±0.37)% and teratogenic rate (1.84±0.55)% when compared with controls. CPP intramuscular implantation also did not cause obvious surrounding tissue inflammatory reaction. CONCLUSION: CPP is a new safe medical material with good tissue compatibility.

　　【Keywords】 calcium polyphosphate fibers; absorbable implants; toxicology; security

　　【摘要】 目的: 评价CPP材料的生物安全性. 方法: 采用聚磷酸钙（CPP）材料萃出液腹腔注射（IP）最大允许剂量，进行了该材料最大耐受量测定，并用IP最大耐受量进行了小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸变试验、小鼠骨髓细胞染色体畸变试验、致畸试验等毒理学试验，评价其安全性；同时采用体内肌肉包埋法，观测其对对周围组织的反应，对CPP材料生物相容性进行评价. 结果: CPP材料萃出液的最大耐受量大于40 mL/kg，最大耐受量的CPP对小鼠骨髓细胞微核率(1.36±0.27)‰，小鼠骨髓细胞染色体畸变率（1.94±0.46)%和小鼠精子畸变率（1.51±0.37）%，致畸试验畸发率(1.84±0.55)%和对照组比差异无统计学意义(P>0.05)，CPP材料肌肉包埋后组织反应不明显. 结论: CPP材料是一种安全而理想的可吸收性生物医用材料.

　　【关键词】 聚磷酸钙纤维；可吸收性植入物；毒理学；安全性

　　0引言

　　为研制可吸收性高强度骨折内固定复合材料，我们选用在化学和晶体学特征上与人体骨矿物质相近的聚磷酸钙（calcium polyphosphate, CPP）,经熔融抽丝工艺制得可吸收性高强度复合材料增强物―CPP纤维，为判定其是否满足医用要求，我们参照国内外相关，采用CPP材料萃出液腹腔注射最大允许剂量，进行了该材料毒理学试验；同时采用体内肌肉包埋，观测其对组织学的反应，对CPP材料安全性进行评价.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1聚磷酸钙纤维制备［1-2］采用化学成分与人体骨矿物质成分相近的化学纯磷酸二氢钙(或偏磷酸钙)为主要原料，通过添加适量的稳定剂S和阻降剂M，置于坩埚中，一并放入自制的拉丝炉中，缓慢升温至1000℃. 原料先变为白色粉末,继而成为液态,然后使其缓慢冷却,在冷却过程中以自制拉丝机拉丝，用熔融拉丝的方法，制备出聚磷酸钙纤维. 以19JA型万能工具显微镜测得单丝直径在5~250 μm范围内，密度为2.3 g/cm3.

　　1.1.2动物昆明种健康小鼠（西安大学医学院实验动物中心提供），体质量18～22 g；健康新西兰兔(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，体质量2.0～2.5 kg.

　　1.2方法

　　1.2.1CPP材料萃出液的制备参照文献［3］，取直径50 μm CPP纤维30 cm，经灭菌处理后，放入100 mL无菌生理盐水中，37℃下密闭温育72 h，制备萃出液备用.

　　1.2.2CPP材料萃出液最大耐受量测定按国标（GB1519394）［4］方法进行. 昆明种小鼠20只，雌雄各半，体质量18~22 g, 禁食而不禁水12 h后腹腔注射CPP复合材料萃出液每1 kg质量40 mL，观察7 d内动物反应及死亡情况.

　　1.2.3小鼠骨髓细胞微核试验按国标（GB1519394）［4］方法进行. 昆明种小鼠30只，雌雄各半，体质量18~22 g, 随机分为CPP试验组（IP最大耐受量的CPP萃出液）、阴性对照组（生理盐水）和阳性对照组（环磷酰胺40 mg/kg）共三个试验组. 每日IP给药1次，共7次，于末次给药后6 h脱臼处死，取胸骨制成骨髓涂片，Gimsa染色，每只小鼠计数嗜多染红细胞1000只，微核发生的千分率.

　　1.2.4小鼠精子畸变试验按国标（GB1519394）［4］方法进行. 体质量25~35 g雄性小鼠30只，分组给药同1.4微核试验. 阳性对照用乙酰水杨酸，于末次给药后6 h用颈椎脱臼法处死小鼠，取出两侧副睾，放入盛有适量生理盐水（1 mL）的平皿中. 用眼科剪将副睾纵向剪1~2刀，静置3~5 min，轻轻摇动. 用四层擦镜纸过滤，吸滤液涂片. 于空气中干燥后，甲醇固定. 用10~20  g/L伊红染色1 h，用水轻冲，干燥. 在低倍镜下找到背景清晰、精子重叠较少的部位，用高倍镜顺序检查精子形态，计数结构完整的精子. 每只小鼠至少检查1000个精子. 以便统计精子畸形率.

　　1.2.5小鼠骨髓细胞染色体畸变试验按国标（GB1519394）［4］方法进行. 分组给药同1.4微核试验. 阳性对照组小鼠处死前2～4 h，按4 mg/kg体质量腹腔注入秋水仙素. 小鼠颈椎脱臼处死，取股骨，去除附着的肌肉，剪去两端骨骺，用带针头的注射器吸取2～4 mL 22 g/L柠檬酸钠溶液，将骨髓洗入10 mL离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以1000～1500 r/min离心10 min，弃去上清液. 离心后的细胞沉淀物加入4 mL 75 mmol/L氯化钾溶液低渗处理，用新配制甲醇冰乙酸固定液固定，细胞悬液制片，Giemsa染色，空气中干燥后镜检. 每只动物分析100个中期相细胞，每组不少于1000个中期相细胞. 观察染色体数目和结构改变.

　　1.2.6致畸试验按国标（GB1519394）［4］方法进行. 健康性成熟昆明种小鼠，雌性60只，雄性30只，按二雌一雄合笼交配，将每天检出的受孕雌鼠，按微核试验平均随机分配，每剂量组受孕鼠为20只. 每剂量组的孕鼠检出精子的当天作为受孕0 d，于小鼠孕期6~15 d给药，阳性对照为乙酰水杨酸. 于孕期第20日将孕鼠颈椎脱臼处死，剖检子宫及胎仔，检查胎仔有无畸形.

　　1.2.7肌肉包埋试验将自制CPP制成直径为2 mm，长10 mm的柱状体，环氧乙烷消毒备用. 用常规骨水泥(PMMA)制成同样大小的棒材作对照. 取健康新西兰兔12只，体质量2.0～2.5 kg，手术前1 d背部脊柱两侧备皮，戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，取背部正中纵行切口，钝性分离右侧竖脊肌，植入CPP棒材共4枚，平行于脊柱，离中线25 mm，各植入物间隔约25 mm， 同法在对侧植入PMMA骨水泥作对照，逐层缝合至皮肤. 于术后1，4，8，12 wk分别处死动物3只，切取实验组及骨水泥组周围肌肉组织做常规病理切片， HE染色. 观察材料周围组织炎症细胞变化情况、纤维包膜形成情况及有无肌肉钙化、坏死. 按国标（GB/T 161751996）［5］对肌肉包埋实验炎症细胞反应、纤维囊腔形成进行分级后评价.

　　统计学处理：应用SPSS 12.0统计软件包进行统计分析,经检验,实验数据均符合正态分布,故采用x±s表示，组间比较采用KruskalWallis检验,多重比较采用Nemenyi检验.

　　2结果

　　2.1CPP材料萃出液最大耐受量预试验结果表明，CPP材料基本无毒，测不到LD50；最大耐受量测定结果表明，一次腹腔注射 CPP材料萃出液每1 kg质量40 mL，观察7 d内小鼠未见死亡，也未见异常反应. 说明CPP材料萃出液对小鼠的最大耐受量大于40 mL/kg.

　　2.2小鼠骨髓细胞微核试验CPP组的微核细胞数和阴性对照组相似，差异无统计学意义(P>0.05)，而环磷酰胺组的微核细胞数，和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01，表1).表1CPP材料萃出液对小鼠微核发生率的影响（略）

　　2.3小鼠精子畸变CPP组的精子畸变率和阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，而阳性对照组的精子畸变率和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01，表2).

　　2.4小鼠骨髓细胞染色体畸变CPP组的染色体畸变率和阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，而阳性对照组的染色体畸变率和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01，表2).

　　2.5致畸CPP组和对照组胚仔外观和内脏发育未出现明显畸变. 而乙酰水杨酸组则出现胚仔头面与身体的畸形如脑露、脊椎裂，侧脑室扩大，脑骨、骨柄、颞骨、蝶骨、枕骨的未骨化和骨化不全等，总畸变率为（80.10±11.00）%（表2）.表2CPP材料毒理学检测结果（略）

　　2.6CPP材料肌肉植入试验对兔肌肉组织反应

　　2．6．1实验动物的大体观察所有动物均成活，伤口无红肿，愈合良好，无感染及窦道产生，未见变态反应、中毒及热源反应. 手术伤口愈合良好，未见感染及窦道产生.

　　2．6．2试件标本的大体观察术后1 wk，试件表面光泽稍暗淡，光滑平整；4 wk，试件形态无变化，透明度稍有降低；8 wk，试件透明度呈不均匀降低，形态仍无变化；12 wk，试件呈不均匀乳白色，表面光洁度下降， 试件仍完整，表面有点凹状吸收.

　　2．6．3组织切片光镜观察CPP棒植入兔竖脊肌后HE染色观察：1 wk，未见纤维囊形成，可见较多的炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，淋巴细胞相对较多，偶见巨细胞反应(图1)；4 wk后，可见大量成纤维细胞形成，炎性细胞少见，纤维包膜界限较清晰(图2)；8 wk后，纤维包膜界限清晰，厚度较4 wk时变薄，可见少许淋巴细胞(图3). 12 wk胶原纤维致密变薄，成纤维细胞减少，只见少量淋巴细胞(图4). PMMA组肌肉组织学变化与试验组无明显差异. 实验结果符合国标（GB/T161751996）［5］中对医用有机材料植入生物学评价试验的要求，说明材料对周围组织无刺激性.

　　3讨论

　　生物相容性要求医用材料植入体内后，必须对人体无毒性、无刺激性、无抗原性、无遗传毒性和致癌性，与组织、细胞接触无任何不良反应. 因此，材料的生物相容性优劣是生物医用材料研究设计中首先考虑的重要问题.

　　较多的炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，淋巴细胞相对较多，偶见巨细胞反应.

　　作为体内植入的可吸收性生物医用材料，对其生物学特性要求极为严格. 在一种新型材料临床应用前，须完成其毒特性检测，综合评定其生物学特性是否符合医用要求［6-7］. 为此，我们对这一新型材料毒理学进行了评价，为其应用于骨科临床提供重要的理论依据. 毒理学实验结果表明， 最大耐受量的CPP材料不影响小鼠骨髓细胞微核率、小鼠骨髓细胞染色体畸变率和小鼠精子畸变率，致畸试验阴性，说明CPP材料对机体无毒.
胶原纤维致密变薄，成纤维细胞减少，只见少量淋巴细胞.

　　当医用材料植入体内某一部位时，局部的组织对异物的反应属于一种机体防御性应答反应，植入物体周围组织将出现白细胞、淋巴细胞和吞噬细胞聚集，发生不同程度的应激反应. 当材料有毒性物质渗出时，就会出现局部炎症不断加剧，严重时出现组织坏死. 植入物在体内长期存在时，材料被淋巴细胞、成纤维细胞和胶原纤维包裹，形成纤维性包裹，使正常组织和材料隔开. 如果材料无任何毒性，性能比较稳定，组织相容性良好，则在0.5 a，1 a或更长时间包裹囊变薄，囊壁中的淋巴细胞消失，在显微镜下只见到很薄的1～2层成纤维细胞形成的无炎性反应的正常包膜囊.

　　植入试验是目前国际上通用的评价医用生物材料对组织毒性刺激反应、生物材料安全性的一种重要的体内实验方法. 在无明显损伤和感染条件下，若材料中无有害物质存在，组织反应在早期呈现异物刺激引起的轻、中度炎症反应，2 wk以后转化为慢性炎症病理变化. 材料中任何低分子物质或其他化学溶剂的存在，都将影响炎症反应时间的长短和囊壁形成的厚薄及疏密. 一些学者认为，将CPC植入体内后，能与周围组织良好共存，未发现正常生理过程出现改变，未见明显炎性反应， 无异物巨细胞及排斥反应出现，未发现有致畸性［8-12］. 本材料植入兔肌肉后亦得出类似试验结果，符合标准要求；肌肉内植入后早期有轻度炎性反应，后期形成薄层包膜，与常规对照组无明显差异. 说明CPP材料安全性良好.

　　上述毒理学检测及安全性评定结果表明，CPP材料对机体无毒，对周围组织反应小，并具有良好生物相容性，是一安全而理想的可吸收性生物医用材料.

　　【】

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