GFP共表达的重构型Caspase

         作者：余晓林，刘红，陈万平，程鹏远

【关键词】  基因转染

    Effects of recombinant Caspase3 on human laryngocarcinoma cell line Hep2 through coexpression with GFP

　　【Abstract】 AIM: To investigate the apoptosis induction effect of the expression of recombinant Caspase3 on laryngocarcinoma cell line Hep2. METHODS:  Recombinant Caspase3 gene was subcloned into the GFP reporting vector pEGFPC1 to generate the expressing vector pEGFPCaspase3 by DNA recombinant technique. Human laryngocarcinoma cell line Hep2 was transfected with Caspase3 gene by Lipofectamine 2000 and the expression of recombinant Caspase3 was observed by RTPCR. The cell morphological changes were observed under fluorescent and electronic microscope and the cell survival rate after transfection was assayed by MTT method. RESULTS:  Recombinant Caspase3 gene was stably expressed in Hep2. Recombinant Caspase3 induced obvious apoptosis in vitro. The MTT results suggested that the cell curve declined after transfection with Caspase3. CONCLUSION:  Recombinant Caspase3 can inhibit the growth of the laryngocarcinoma cell line Hep2 and effectively induce it to apoptosis.

　　【Keywords】 Caspase3; apoptosis; gene transfection

　　【摘要】 目的：探讨GFP共表达的Caspase3基因的表达对人喉癌细胞Hep2的凋亡诱导作用. 方法：应用DNA重组技术将重构型 Caspase3基因亚克隆至带有GFP报告基因的真核表达载体pEGFPC1中，脂质体介导转染人喉癌细胞Hep2，通过RTPCR方法检测转染后Caspase3基因的表达；荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化； MTT法检测转染Caspase3基因对Hep2细胞生长的影响. 结果：RTPCR方法证实重构型Caspase3基因可在Hep2细胞内表达，形态学观察显示转染组细胞较对照组出现明显细胞凋亡特征，MTT法结果表明Caspase3对Hep2的细胞生长有抑制作用. 结论：重构型caspase3对喉癌细胞Hep2的生长有抑制作用，并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡.

　　【关键词】 Caspase3基因； 凋亡； 基因转染

　　0引言

　　凋亡与肿瘤的发生有密切的关系，Caspase3被激活后，使细胞发生凋亡［1］，目前研究表明Caspase3基因对肝癌细胞等具有明显促凋亡作用，但在喉癌细胞中是否具有诱导凋亡活性，我们研究重构型Caspase3在喉癌细胞的凋亡诱导活性并为喉癌的基因提供一定实验基础如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人喉癌细胞Hep2由第四军医大学门诊部保存；PCR试剂盒购自华美生物工程公司；RTPCR试剂盒、细胞总RNA提取试剂Trizol、转染试剂Lipofectamine2000、新生牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司；小量质粒提取试剂盒、T4 DNA连接酶均购自Promega公司；含具有自发活性的重构型Caspase3基因的pcDNA3revCasp3真核表达载体由第四军医大学门诊部保存，重构型人Caspase3基因克隆于该载体的EcoRI和XbaI位点间；pEGFPC1载体购自Clontech公司，其上携带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因.

　　1.2方法

　　取约3 μg pcDNA3revCasp3及pEGFPC1载体分别经EcoRI和XbaI双酶切，各自回收并纯化片段及载体后按照3∶1比例经T4连接酶4℃连接过夜并转化0.1 mol/L CaCl2制备的E.coli DH5α感受态细菌，涂布于含卡那霉素(0.05 g/L)的LB培养板，37℃培养过夜. 随机挑选阳性重组质粒小量质粒提取试剂盒提取质粒并经EcoRI和XbaI双酶切进行鉴定，重组质粒命名为pEGFPCaspase3.

　　1.2.1基因转染细胞形态观察转染前24 h将细胞分别铺于6孔板，待细胞生长至约70％时，分别取lipofectamine2000转染试剂8 μL及3 μg pEGFPCaspase3质粒、pEGFPC1空载体分别稀释于250 μL无血清DMEM，5 min内将稀释的质粒脂质体混合后室温静置20 min后，将混合物逐滴加入到6孔板后置于37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养. 转染后的1~6 d取倒置显微镜观察细胞形态变化.

　　1.2.2检测重构型人Caspase3基因的表达取转染后48 h Hep2细胞约1×106个，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，1000 r/min离心5 min后弃去培养基，1倍PBS洗2次并收集细胞. 以Trizol试剂盒提取转染细胞总RNA，逆转录反应按照反转录试剂盒操作进行，取5 μL反转录产物为模板进行PCR扩增，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，取4 μL PCR产物，在含0.5 mg/L溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶(15 g/L)中电泳分析，紫外观测仪观察结果.

　　1.2.3荧光显微镜观察基因表达转染后的1~6 d分别于荧光显微镜下观察表达载体上GFP报告基因的表达，间接监测表达载体及目的基因的表达情况，同时对荧光显微镜下细胞形态变化进行观察.

　　1.2.4转染Caspase3基因后细胞凋亡的电镜检测Hep2细胞株转染Caspase3基因后48 h经胰酶消化，PBS洗涤，离心去上清，沿管壁缓加入25 g/L戊二醛，4℃固定2 h，拨离细胞团块，PBS洗涤2次，常规脱水，包埋，制备超薄切片，染色，水洗，晾干，电镜观察.

　　1.2.5MTT法测定转染Caspase3对Hep2细胞的抑制作用将未转染的Hep2细胞以2.5×107／L的密度接种于96孔板，每孔200 μL, 保留一排孔作为调零孔，待细胞贴壁后，分3组（转染组、空载体组、不转染组）进行转染，每组不同时间点平行3孔(n=3). 分别于转染后的不同时间点（12，24，36，48，60，72 h）吸弃培养液，加入200 μL新配制的MTT(5 g/L)，37℃继续孵育4 h, 弃MTT液加入DMSO 150 μL，混匀，待所有样品作完上述处理后，用DG3022型酶标仪，测490 nm波长吸光度，并作图将实验组与对照组进行比较.

　　统计学处理：所有数据采用x±s表示，采用SPSS 12.0软件处理，组间比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1pEGFPCaspase3表达载体的酶切鉴定酶切产物在含0.5 mg/L溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶(15 g/L)中电泳分析，紫外观测仪观察结果(Fig 1).

　　2.2重构型人Caspase3基因的RTPCR检测Caspase3基因在Hep2细胞中mRNA水平得到表达，而空载体组及空白组细胞没有检测到相应大小的特异性片段(Fig 2).

　　2.3Caspase3转染细胞的荧光显微镜观察pEGFPC1空载体转染细胞生长良好，荧光较强(Fig 3A)；而pEGFPCaspase3转染后48~72 h，生长状况不同程度变差，生长增殖缓慢，许多细胞轮阔不清，甚至有的细胞已经死亡(Fig 3B).

　　2.4电镜观察结果重组型Caspase3转染细胞在转染后48 h出现细胞体积缩小，膜表面出泡，或细胞质形成较多空泡，核膜发生皱折，或染色质凝缩，聚集于核膜下，有的形成凋亡小体，均为凋亡细胞的典型特征(Fig 4).

　　2.5转染Caspase3基因后对Hep2细胞的抑制MTT法测定结果显示：转染Caspase3基因组细胞A值与对照组细胞相比较存在差异，基因转染36 h后Caspase3转染组细胞A值明显降低，较对照组及空载体组之间的差异均有显著性意义(P<0.05)，而且这种抑制作用持续到72 h；而空载体组细胞转染后A值较对照组之间差异无显著性意义(P>0.05, Fig 5).

　　3讨论

　　Caspase，即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartatespecific protease)，是一类在细胞凋亡中起关键作用的蛋白酶家族［2］，活化后的Caspase3识别底物蛋白特异的四肽序列，并在天冬氨酸羧基侧切割蛋白质，从而导致多种细胞结构及功能蛋白失活，或促凋亡蛋白活化，使细胞走向凋亡［3］. 我们通过将重构的具有自发活性Caspase3基因克隆入至表达载体pEGFPC1后转染Hep2细胞后，RTPCR结果表明Caspase3基因得到表达. 绿色荧光蛋白GFP的共表达，可直观地反映外源基因在细胞内的表达量，同时可清晰地显示细胞的形态和结构［4］. 实验表明，重组型Caspase3在Hep2细胞中得到表达，随后可导致细胞生长状况变差，蛋白质(包括GFP)合成水平下降及大量细胞发生死亡. 许多被转染的细胞呈现出典型的凋亡细胞的结构特征. 转染Caspase3后抑制了细胞的生长表明，重构型Caspase3基因的表达可以通过诱发细胞凋亡的途径抑制喉癌细胞Hep2细胞生长增殖，甚至导致大量细胞死亡，验证了重构型Caspase3在喉癌细胞中的凋亡诱导活性［5］. 重组型caspase3的促凋亡活性有希望使其成为喉癌基因中的新型效应分子［6,7］.

　　【】

　　［1］ Hengarner MO. Apoptosis: Corralling the corpses［J］. Cell, 2001;104(3):325-328.

　　［2］   Philchenkov AA. Caspases as regulators of apoptosis and other cell functions［J］. Biochemistry, 2003; 68(4):365-376.

　　［3］   Blocksom JM, Huang J, Kerkar S, et al. Endothelial cells protect against lipopolysaccharideinduced caspase3mediated pericyte apoptosis in a coculture system［J］. Surgery, 2004;136(2):317-322.

　［4］ 马龙洋,刘家云,许彦鸣,等.针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定［J］. 第四军医大学学报,2005;26(8):676-678.

　　Ma LY, Liu JY, Xu YM, et al. Construction and identification of RNA interference expression vector targeting EGFP［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2005;26(8):676-678.

　　［5］ 贾林涛,于翠娟,许彦鸣,等. Caspase3 融合蛋白基因的构建及其对HeLa细胞凋亡的诱导作用［J］.第四军医大学学报,2001;22(12):1057-1060.

　　Jia LT, Yu CJ, Xu YM, et al. Construction and effect of caspase3 fusion proteins and their apoptosis induction in HeLa cells［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(12):1057-1060.

　　［6］ Choi BT,Cheong J,Choi YH. BetaLapachoneinduced apoptosis is associated with activation of caspase3 and inactivation of NFkappaB in human colon cancer HCT116 cells［J］. Anticancer Drugs, 2003;14(10):845-850.

　　［7］ Fedorov SN, Bode AM, Stonik VA, et al. Marine alkaloid polycarpine and its synthetic derivative dimethylpolycarpine induce apoptosis in JB6 cells through p53 and caspase 3dependent pathways［J］. Pharm Res,2004;21(12):2307-2319.