壳聚糖对自制磷酸钙骨水泥性能的影响

　　作者：　潘朝晖，范清宇，蔡和平，马保安，黄波，姜林莉，文艳华　

【关键词】  ,磷酸钙骨水泥

    Effects of chitosan on properties of selfmade calcium phosphate cement

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of chitosan on the physical characteristics, ultramicrostructure and biocompatibility of a selfmade calcium phosphate cement (CPC). METHODS:  Two different cement formulations were prepared by mixing CPC powder respectively with 50 g/L chitosan lactate and 1 mol/L dibasic sodium phosphate used as liquid phase. For physical properties, washout resistance, primary setting time and compressive strength were measured. Scanning electron microscopy (SEM) was used to examine the microstructure and the intramuscular implantation of a rat model and rat mesenchymal stem cells (RMSC) seeded on CPC disks were used to compare the biocompatibility of the two formulations. RESULTS:  CPCchitosan composite was more stable in water than conventional CPC and it did not disintegrate within 3 min even when placed in water immediately after the mixing. The mean setting time was 8.38 min in CPCchitosan and 23.68 min in the control. The mean compressive strength of composite increased to 6.52 MPa, whereas the control samples exhibited much lower values (2.08 MPa). SEM examinations showed that globular and platy particles were formed on surfaces of all samples but the particles on the surface of the CPCchitosan composite seemed to connect together viscously, with smaller pores than those of control. Slight signs of inflammation, which disappeared after four weeks, were detectable around the specimens implanted within one week. After 12 weeks, the experimental implants became soft, while the controls remained the same in appearance. Necrosis was not detected in the muscles around the implants. SEM showed that cells adhered to CPCchitosan composite disks, but the visible amount of the adherent cells was greater than that of control. CONCLUSION:  Chitosan is suitable for the stabilization of CPC in a wet environment for it accelerates the setting reaction and improves the mechanical properties and biocompatibility of the cements.

　　【Keywords】 calcium phosphate cement； chitosan； compressive strength； biocompatibility

　　【摘要】 目的：了解壳聚糖对自制磷酸钙骨水泥（CPC）物理性能、超微结构及生物相容性的影响. 方法：分别以50 g/L乳酸壳聚糖和1 mol/L磷酸氢二钠为液相制备CPC试样，通过防水试验、测定初步凝结时间、抗压强度；扫描电镜观察凝固体超微形态；大鼠肌肉植入及骨髓基质干细胞表面种植试验比较两者差异. 结果：复合壳聚糖的CPC在水中更稳定，混合后即刻投入生理盐水3 min内不散开；平均初步凝结时间8.38 min，对照组23.68 min；平均抗压强度6.52 MPa；对照组2.08 MPa. 扫描电镜发现凝固体表面为颗粒状及片状晶体，实验组晶体互相连接，孔隙较对照组少. 植入肌袋1 wk有轻微炎症反应，4 wk后反应减退，12 wk后实验组材料变软，对照组外形基本未变. 肌肉无坏死. 电镜下细胞可在水泥盘上贴附、生长, 实验组可见的细胞数较多. 结论：CPC壳聚糖复合物在潮湿条件下更稳定，固化时间缩短，抗压强度提高，生物相容性更好.

　　【关键词】 磷酸钙骨水泥；壳聚糖；抗压强度；生物相容性

　　0引言

　　骨缺损是困扰矫形、颌面、脑外科的一个常见而又棘手的难题. 自固化磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement, CPC）终产物的化学结构与骨的矿物成份相似，具有良好的生物相容性、可降解性、骨传导性，并且可随意塑性，与周围骨组织紧密连接等多种优点［1］，因而得到材料界及医学界的重视，成为骨缺损修复材料研究和应用的一个热点. 但是普通CPC缺乏韧性、固化时间长、降解速度较慢、抗压强度低等不足使其临床应用受到一定限制. 如何进一步改性，更好地满足临床需要成为研究的焦点. 研究发现改变其固相颗粒大小、液相、液固比例、温度，添加适当的有机或聚合材料等方法可以在一定程度上改善其性能 ［2-5］.

　　壳聚糖（chitosan, CS）是地球上含量极为丰富，仅次于纤维素的天然聚合体―甲壳素的脱乙酰化衍生物，其结构与硫酸软骨素、透明质酸等物质类似，是一种由2氨基2脱氧βＤ葡萄糖通过β1,4糖苷键聚合的天然聚阳离子多糖. 研究表明CS可被包括溶菌酶在内的多种特异或者非特异性酶降解为氨基葡萄糖而被吸收，并且具有生物相容性、止血、抗感染、可塑性及黏附性等诸多优点［6］， CS单独或者与复合其他材料可制作敷料、释放药物、基因的载体、生物涂层、组织工程支架等［7］. 我们拟研究CS对自制的自固化CPC性能的影响.

　　1材料和方法

　　1.1CPCCS复合物的制备参照［8］所述方法制备无水磷酸氢钙和磷酸四钙，球磨过筛，前者平均粒径1 μm，后者17 μm. 等摩尔比混合作为CPC固相. 液相：实验组50 g/L乳酸壳聚糖（上海源聚生物公司)，对照组1 mol/L磷酸氢二钠. 粉(g)∶液(mL)=2∶1.

　　1.2防水试验用手将0.3 g CPC粉及0.15 mL液体揉合，作成小球，立即放入含4 mL 37℃生理盐水内的小瓶内,比较肉眼可见的散开程度.

　　1.3初步凝结时间测定0.6 g CPC粉与0.3 mL液体在玻璃板上混合30 s后，置入直径5 mm高12 mm玻璃管内，塑料膜覆盖管顶及管底，C型夹固定，置于相对湿度100%，37℃湿盒内，定期取出用水泥凝结时间测定仪（上海东星建材实验仪器有限公司）间隔不同时间测定. 从试针接触试样表面，让滑杆自由滑下，至试针插入试样不超过1 mm所需时间为水泥初步凝结时间（n=5）.

　　1.4抗压强度测定标准抗压试件为直径比高度小于2的圆柱体. 0.6 g CPC粉与0.3 mL液体混合，装入直径5 mm高12 mm模具，直径5.6 mm不锈钢棒周期挤压（压力约19.6 N）. 脱模后，放入直径8 mm高20 mm玻璃管内，塑料膜封口， 37℃相对湿度100%的湿盒内固化2 d. 标本放在材料万能试验机量压缩头之间，抗压测试加载至试件变形，记录最大压力，抗压强度（n=5）.

　　1.5扫描电镜分析样品的形态力学测量后断裂表面脱水干燥并经真空镀膜仪表面喷金，扫描电镜(日产JSM35C型)观察各样本表面形态.

　　1.6肌肉植入试验0.2 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物后，背部正中纵行切口，小心分离脊柱两侧椎旁肌肉形成肌袋，各植入经γ射线灭菌的实验及对照组水泥柱一枚，分别于术后1 wk，1 mo，3 mo照相、取材，40 g/L多聚甲醛缓冲固定液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色. 每组4只SD大鼠（第四军医大学实验动物中心）.

　　1.7细胞种植实验及对照组分别制备成直径10 mm，厚4 mm 的水泥盘，固化48 h后乙醇漂洗2次，γ射线灭菌. 取成骨性培养基条件下培养的第2代大鼠骨髓基质干细胞，胰酶消化以1×105个/mL种植于水泥盘. 2 d后PBS液洗涤10 min, 10 g/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，真空干燥，喷金. 再次以扫描显微镜观察.

　　统计学处理：所有数据均用x±s表示，SPSS软件两独立样本t检验比较试样初步凝结时间及抗压强度. 检验水准设为P＜0.05.

　　2结果

　　2.1防水试验水泥小球放入装有生理盐水的瓶中，对照组产生较多水泡，很快散开；实验组只有很少的水泡，可保持原来的外形3 min.

　　2.2水泥初步凝结时间测定实验组(8.4±1.2) min，对照组(23.7±2.7) min. Levene方差齐性检验F=0.596，P=0.462，可以认为两样本方差相等，进行方差齐性检验时，t=-20.455, P≈0.000,认为两者差异有统计学意义.

　　2.3抗压强度测定实验组(6.52±1.61) MPa，对照组在(2.08±0.70) MPa. Levene方差齐性检验F=0.393，P=0.548，可以认为两样本方差相等，进行方差齐性检验时，t=6.732, P≈0.000,结果两者差异有统计学意义.

　　2.4超微结构分析扫描电镜检查发现试样的表面均有颗粒状晶体形成，较多微孔，分布均匀，直径几个至十几个微米. 添加CS后，晶体仍然呈现颗粒状，证明添加CS对水泥的固化反应产物未形成影响. 只是颗粒间互相连接更加紧密，孔隙较对照组少（Fig 1）.

　　2.5肌肉植入试验术后老鼠饮食、活动正常，伤口愈合良好. 大体观察1 wk时有轻微炎症反应，4 wk后炎症反应消失，柱状体包裹在肌肉内，两者间无纤维膜. 12 wk后实验组质地变软，可见软组织长入，对照组基本维持原来植入的形状. 未见肌肉坏死.

　　2.6细胞种植扫描电镜观察细胞种植于材料表面3 d后，于表面贴附生长，呈多边形. 实验组材料表面的细胞数目多，细胞呈现团块生长，对照组的细胞数目少（Fig 2）.

　　3讨论

　　CPC是20世纪80年代中期研制的自固化型、非陶瓷类羟基磷灰石（HA）类人工骨材料. 其固、液相按比例混合后，先形成一种可任意塑形的膏体，在室温或者体内环境下凝固可转变成含微孔结构的HA晶体. 理想的抗压强度，适宜的凝结时间是CPC研究的一个重要方向. 理想的抗压强度应该介于皮质骨和松质骨之间，适当的凝结时间以利于手术进行为原则，一般认为5~20 min为宜. 随着对CPC水合机制的深入研究发现原料成分、颗粒大小及匹配度、钙磷比、晶种、固化液的量、温度等等因素都能显著影响CPC的水合反应，进而影响水泥的理化特性. 同时凝胶、胶原、藻酸钠等添加剂也能改善CPC的性能，但是都不是很理想.我们利用CS作为CPC改性的添加剂，发现添加5%CS可以缩短凝结时间，提高抗压强度. 分析原因可能是当CPC与酸性壳聚糖溶液混合后，酸和钙发生螯合反应，很快凝固形成水凝胶，缩短初步凝结时间. CS由并列的H结合链组成，与天然骨的力学性能更接近，所以能提高复合物的力学性能，同时抗压强度提高还可能与微孔结构减少有关.

　　生物骨替代材料如果不稳定，接触体液或血液后会发生溃散、迁移. 一方面会影响成骨，因为在骨愈合的初期植入材料的稳定非常重要；另一方面可能损伤健康组织. 模拟生物材料(analogue biomaterials)概念的提出引发了生物活性微粒加聚合体基质构成仿生骨这一思路［9］. 生物活性成分促周围组织生长，将组织和植入材料牢固结合，聚合体基质则提供材料的柔韧性，限制颗粒的迁移. 我们利用壳聚糖作为基质，改善CPC的粘结性能，限制CPC颗粒的移动，提高其临床操作的柔顺性、抗水冲刷能力. 随着复合物在体内降解，壳聚糖可为骨基质合成提供氨基多糖原料. 当然这仅仅是简单材料组成的模仿，绝非是真正意义上的仿生.
CPCCS复合物生物相容性如何是进行进一步动物实验前必须考虑的问题. 对生物材料相容性评价方法主要有两类：一是动物体内实验，即将材料植入体内，分阶段将植入体与周围组织取出，行组织学检查，观察材料及周围组织病理变迁. 二是体外实验，观察材料或材料浸提液对组织细胞生长及代谢的影响［10，11］. 从理论上讲，CPC水合过程中以及水合后的产物HA呈碱性；壳聚糖溶解于弱酸溶液内，其代谢产物也呈酸性. 两者可能正好中和［12］从而减轻因为非生理性pH值所引发的不良反应，而且CS表面为亲水基团，可以有利于吸附血清或者体液内的细胞外基质蛋白，从而促进细胞黏附及增殖. 短期肌肉植入试验发现在固化体植入后，两者局部有炎性反应，植入区有炎性细胞浸润，但是随着观察期延长，反应减轻直至消失，说明炎性反应在一定程度上是由手术创伤所致. 各时间段病理检查未见肌肉坏死. 3 mo后实验组软化，可见大量软组织长入，可能与CS的吸收有关，而对照组仍然是植入时的形状. 要完成骨愈合，支架材料必须有利于成骨前体细胞迁徙、贴附、分化. 由于材料不透光，所以本实验选用细胞种植扫描电镜观察的方法，发现成骨条件培养基中诱导后的大鼠骨髓基质干细胞可以在复合材料表面很好的生长. 从而证实材料无细胞毒性作用，适合成骨前体细胞的贴附、生长.

　　本研究初步显示，CS可以改善自制CPC的理化及生物相容性. 复合材料的成骨性能如何还有待进一步研究.

　　【】

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