损毁帕金森病大鼠腹侧苍白球对纹状体内谷氨酸含量的影响

          作者：曾水林，李涛，杨鹏，康学军，萧静，黄晓，刘俊华

【关键词】  帕金森病

    Content changes of glutamic acid in striatum induced by lesion of ventral pallidum in rats with Parkinsons disease

　　【Abstract】 AIM:  To observe the content changes of glutamic acid (Glu) in the striatum after lesion of ventral pallidum (VP) in Parkinsons disease (PD) rats. METHODS:  The model of PD was made by injecting 6hydroxydopamine (6OHDA) into the left substantia nigra pars compacta (SNc) and ventral tegmental area (VTA) of the rats. After damaging VP of the PD rats, we observed the changes of rotation behavior and detected the content of Glu in striatum by high pressure liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection analysis. RESULTS:  After lesion of VP, the rotating behavior decreased markedly, and the content of Glu in striatum (μg/g) (3.0±0.4) was higher than that in normal (2.2±0.7),  model (1.3±0.2) and sham groups (1.4±0.4)（P<0.05）. It reached the peak at 2nd  week then subsided, but still higher than that in other groups. CONCLUSION:  Lesion of VP can block the release of Glu or check its combination with its receptors, thus reducing the neural toxicity of Glu. These effects may be beneficial for the treatment of PD.

　　【Keywords】 Parkinsons disease; ventral pallidum; glutamic acid; rats

　　【摘要】 目的： 观察腹侧苍白球(VP)损毁后帕金森病(PD)大鼠纹状体内谷氨酸(Glu)含量的变化. 方法： 应用6羟基多巴胺(6OHDA)制备偏侧PD大鼠模型，插入电极直流电毁损VP，观察毁损后PD大鼠的旋转行为，应用高效液相色谱检测纹状体内Glu的含量. 结果： VP损毁术后PD大鼠偏侧旋转行为明显改善,纹状体内Glu的含量(μg/g) (3.0±0.4)比正常对照组(2.2±0.7) 、模型对照组(1.3±0.2)和假手术组(1.4±0.4)都要高（P<0.05），在术后第2周时达高峰，以后逐渐下降，但仍高于其他三组. 结论： VP毁损可能会减少Glu的释放或与其受体的结合，从而对神经元的毒性作用减弱，有助于PD症状的改善.

　　【关键词】　帕金森病；腹侧苍白球；谷氨酸；大鼠

　　0引言

　　帕金森病(Parkinsons  disease, PD)是中老年中枢神经系统的退行性变疾病. 用微电极导向核团毁损术PD，具有显著改善其症状、损伤小、副作用少等优点，因而对于用药物难以控制的中晚期PD患者，这种方法已成为首选的治疗手段. 近年来的研究表明，兴奋性通路对控制PD运动症状起关键性的作用. 本实验我们探讨直流电毁损腹侧苍白球(ventral pallidum, VP) 治疗PD的效果及作用机制，为临床应用核团毁损术治疗PD提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康SD大鼠60只，雌雄不拘，体质量200~300 g. 用4 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，固定于江湾Ⅱ型脑立体定位仪，根据Paxinos等［1］脑立体定向图谱，按照［2］制备PD大鼠模型. 选取平均转速在7圈/min以上者，为合格PD模型大鼠，共计46只，分为3组. ① VP毁损组(VP)28只，常规麻醉、消毒、固定于脑立体定位仪上，根据上述脑立体定向图谱，确定VP的坐标： 前囟后0.4 mm，中线旁开2.6 mm，硬膜下8.0 mm. 钻开颅骨，暴露硬膜，以钨微电极（FHC, USA；尖端直径0.25 mm，外套一自制的玻璃微电极，仅尖端暴露0.5 mm，以保证毁损部位局限在靶区）插入左侧VP，用直流电凝固法毁损VP. 毁损参数： 电极接阳性，阴极接大鼠左后肢，电流1 mA，通电时间15 s，为保证大鼠在术中不出现肌肉抽动行为，可适当调整电流的大小. ② 假手术组(Sham)12只，只作麻醉、消毒、固定于立体定位仪，在以上坐标位颅骨钻孔，VP处插入相同电极，但不进行直流电凝固法毁损. ③ 模型对照组(Model)6只，不进行任何处理. ④ 另取6只正常大鼠设为正常对照组(Normal). VP毁损组和假手术组的大鼠均于术后2 mo内进行2～5次阿朴吗啡(apomorphine, APO)诱导的行为测试［2］. VP毁损组中凡旋转行为手术前后自身对照有明显改善的大鼠记为成功毁损大鼠，而旋转行为没有明显改善的弃用. 经筛选符合要求的VP毁损大鼠共24只.

　　1.2方法

　　各组大鼠于行为测试完毕后，快速断头处死，冰皿上迅速分离纹状体，称质量，置液氮保存. 检测时加入40 g/L的高氯酸200 μL制备匀浆，定容至1 mL后加入10 g/L苯胺100 μL, 4℃低温离心12 290 g,   30 min，取上清液加丹酰氯(Sigma)衍生后加潘生丁(Sigma)内标，离心(4℃低温离心12 290 g, 10 min)，取上清液20 μL用于高压液相色谱荧光检测谷氨酸（glutamic acid, Glu)含量. 色谱条件： 色谱仪(岛津LC10AD)，荧光检测器（岛津RF530），色谱柱为C18柱(北京康林科技有限公司，Kromasil C18, 250.0 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相： 甲醇50 mmol/L,醋酸钠50 mmol/L, （1∶1，其中含四氢呋喃）；激发波长为360 nm，发射波长为500 nm；流速1 mL/min. 检测工作电压为0.7 V，检测灵敏度为20 pg. 经HE染色后，在光镜下对VP毁损组毁损区进行细胞形态学观察，同时判定毁损靶点是否准确.

　　统计学处理： 数据用x±s表示，所获数据采用SAS统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1VP毁损后对PD大鼠旋转行为的影响各组大鼠均于术后2 mo内进行2～5次旋转行为测试，结果显示： 第8周时，Model组为10.3±2.9， Sham组为9.6±1.3， VP毁损组为4.4±2.0. Model，Sham和VP毁损组在各自组内不同时间点比较差别无统计学意义；Model组和Sham组间比较差别亦无统计学意义；而VP毁损与Model和Sham组间差别有统计学意义(P<0.05).

　　2.2HE染色毁损区中心有组织脱落，周围呈现均质状红色染色，无细胞结构，外周有大量炎性细胞浸润.
 
　　2.3纹状体内Glu含量(μg/g)8 wk时Normal组为2.2±0.7, Model组为1.3±0.2, Sham组为1.4±0.4, VP毁损组为3.0±0.4. Normal组高于Model和Sham组（P<0.05）; Model和Sham之间差别无统计学意义(P>0.05); VP毁损组比Normal, Model和Sham三组都要高（P<0.05），在术后2 wk时达高峰3.3±0.8，而后逐渐下降，但仍高于其他三组.

　　3讨论

　　中枢神经系统内的氨基酸类神经递质有兴奋性和抑制性两种，兴奋性递质以Glu为代表，抑制性递质以γ氨基丁酸（gamma aminobutyric acid,GABA）为代表. Glu是“皮质纹状体底丘脑”通路［3,4］中兴奋性神经元突触的主要神经递质，同时又是一种神经毒素. 它通常以囊泡形式贮存于突触前终末内，依赖Ca2+调节而释放入突触间隙，作用于相应受体并发挥其功能. 一般认为细胞外液中没有使Glu失活的水解酶系统，因此从神经末梢释放的Glu的清除和失活，唯一途径是通过位于突触前膜和神经胶质细胞膜上的兴奋性氨基酸转运体（excitatory amino acids transporters,EAAT）的摄取而实现.

　　PD时纹状体内Glu是升高还是降低，至今仍存在争议. Espino等认为PD时纹状体内Glu升高，当Glu浓度增高时，形成对N甲基D天冬氨酸（NmethyDaspartate, NMDA）受体的爆发性占领，NMDA受体过度激活，导致大量Na+, Ca2+持续内流，细胞内Ca2+超载，线粒体呼吸链功能受损，引起多巴胺能神经元的迟发性变性和坏死，进而出现PD症状. 临床上以NMDA受体拮抗剂用于局部或全身后能改善PD的症状，又进一步支持了该推测. 而Tohgi等和Mally等的研究显示PD患者的脑脊液中Glu的含量下降(P<0.01)，而血清中含量却没有变化. 虽然脑脊液中Glu的含量与脑组织内的含量可能不完全相同，但也从侧面表明他们对PD时Glu含量是否增加持不同意见. 我们在实验中观察到PD大鼠纹状体内Glu的含量明显低于正常大鼠. Glu是脑内含量较高的神经递质之一，它的释放受多种因素调节，如离子通道等. Glu在体内有代谢库和递质库之分，代谢库的Glu可以作为中间代谢产物参与物质能量代谢；递质库是指贮存于末梢突触小泡内的Glu. 造成细胞外液Glu浓度升高的原因可能与突触后膜摄取功能下降有关. 释放到组织中的Glu，大部分聚积在突触间隙或弥散到细胞外液，少数经淋巴液丢失，所以在组织Glu代谢库和递质库不变的情况下，神经元释放的Glu越多，则组织内的Glu下降越明显，这也就解释了PD患者血清中Glu升高而脑脊液中下降的原因. 在PD模型中，DA的大量减少，其抑制性作用大幅下降，造成了组织中Glu的释放增加，同时Glu与其受体结合，造成神经毒性作用，而纹状体内检测到的Glu则减少，这与兴奋性氨基酸的毒性作用机制相吻合. 并且有研究［5］显示PD大鼠的Glu下降，除了发生在纹状体以外，还出现在大脑皮质和海马，并引发了相应的症候.

　　在基底核中，底丘脑核(Subthalamic nucleus, STN)发出Glu能神经纤维至苍白球，PD时这一通路的兴奋性增加［6］，从而导致苍白球的过度兴奋，所以临床上PD的外科主要针对STN的深部脑刺激或对苍白球进行毁损以改善PD症状［7］. 我们观察到VP毁损术后纹状体内Glu的含量比模型对照组高，甚至高于正常组，在第2周时达到最高峰，而后逐渐下降，直至第8周仍高于正常组，而假手术组则没有变化. 结合PD大鼠的旋转行为明显改善，可以由此推测VP的毁损并没有改变PD大鼠纹状体内Glu的总量，但是手术的刺激作用可能会减少Glu释放或阻碍其与受体的结合，从而对神经元的毒性作用也减弱.

　　【】

　　［1］Paxinos G,Waston C. The rat brain in stereotaxic coordinate ［M］. 2nd, New York: Academic Press Inc, 1985:

　　［2］杨鹏,李涛,曾水林,等. 苍白球腹侧核毁损对帕金森大鼠旋转行为及纹状体一氧化氮合酶阳性神经元表达的影响［J］. 东南大学学报(医学版),2004;23(2):228-231.

　　Yang P, Li T, Zeng SL, et al. Effects of lesion of VP on the rotation behaviour and nitric oxide　synthase positive neurons in striatum in rats with Parkinsons disease ［J］. J Southeast  Univ (Med Sci Edi), 2004; 23(2):228-231.

　　［3］刘道宽. 锥体外系疾病［M］. 上海: 上海技术出版社,2000;1-16.

　　［4］Lozano AM. Deep brain stimulation for Parkinsons disease ［J］.神经精神疾病杂志，2002;28(1): 1-7.

　　Lozano AM. Deep brain stimulation for Parkinson's disease ［J］. Chin J Nerv Ment Dis, 2002;28(1): 1-7.

　　［5］徐仁，孙圣刚，刘煜敏，等. 实验性帕金森病纹状体、大脑皮质、海马组织Glu含量的变化［J］. 脑与神经疾病杂志，2000;8(1): 65-68.

　　Xu RS, Sun SG, Liu YM, et al. The changes of striatum, cerebral cortex and hippocampus Glu content on experimental Parkinsons disease  ［J］. J Brain Nerv Dis, 2000;8(1):65-68.

　　［6］Parent A, Levesque M, Parent M. A reevaluation of the current model of the basal ganglia  ［J］. Parkins  Relat Dis, 2001; 7(2):193-198.

　　［7］ 冯兴军,高国栋,张华. PD鼠尾壳核内GAD67mRNA的表达及LDopa的影响［J］. 第四军医大学学报,2000;21(4):505-508.