人冠状动脉粥样硬化斑块内细胞成分与斑块稳定性的关系

        作者：郭爱桃，石怀银，韦立新，孙璐

【关键词】  动脉硬化

    Relationship between cell components in human coronary atherosclerosis plaque and stability of plaque

　　【Abstract】 AIM:  To evaluate the relationship between the plaque stability and the cell components in human coronary atherosclerosis plaque and to investigate the interrelation of cell components. METHODS:  One hundred and twentyfive cases of coronary cardiac diseases including acute myocardial infarction, unstable angina and stable angina, who died in recent 12 years and had full data, were selected. The coronary arteries of each case were transversely cut, embedded and stained with HE. After observing and analyzing the morphologic features, parts of the coronary artery segments were selected for immunohistochemical staining of 6 markers against αsmooth muscle actin (SMA), CD20, CD3, CD68, HLADR and mast cell tryptase. RESULTS:  More macrophages, T lymphocytes and mast cells were observed infiltrated in unstable plaque and smooth muscle cells were more common in stable plaque. A significant negative correlation was found between the expression of SMA and CD68, CD3, tryptase. CONCLUSION:  The decrease in the number of smooth muscle cells and the increase in the number of macrophages, T lymphocytes and mast cells may be the major pathologic mechanism responsible for plaque instability. The infiltration of macrophages, T lymphocytes and mast cells is closely related to the decrease of smooth muscle cells in plaque.

　　【Keywords】 arteriosclerosis; unstable plaque; T lymphocytes; macrophages; myocytes, smooth muscle; mast cells

　　【摘要】 目的： 探讨人冠状动脉粥样硬化斑块内细胞成分与斑块稳定性之间的关系，以及各种细胞成分之间有无必然的联系. 方法： 选取解放军总近12年间具有完整资料的急性心肌梗死、不稳定心绞痛和稳定心绞痛尸体解剖病例共125例，对每一例的全部冠状动脉进行取材制片，观察分析形态学指标，并从中挑选一部分蜡块切片行免疫组化染色(包括： SMA， CD3， CD68，CD20， HLADR，  mast cell tryptase). 结果： 免疫组化标记不稳定斑块组SMA的表达明显低于稳定斑块组，而CD68, CD3和mast cell tryptase的表达正好相反（P<0.05）；SMA的表达与CD68, CD3和mast cell tryptase的表达呈明显负相关关系. 结论：  斑块内平滑肌细胞明显减少，巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞显著增高，可能是导致斑块不稳定的主要病机制；斑块内平滑肌细胞数量减少与巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞浸润密切相关.

　　【关键词】 动脉硬化；不稳定斑块；T淋巴细胞；巨噬细胞；肌细胞，平滑肌；肥大细胞

　　0引言

　　冠状动脉粥样硬化斑块破裂并触发血栓形成是导致急性冠状动脉综合征的重要机制， 斑块是否破裂主要取决于斑块的稳定性，斑块自身的组织结构与斑块的稳定性关系非常密切［1，2］. 由于冠状动脉粥样硬化的动物模型复制不理想以及人体材料来源困难，国内采用人体材料对斑块中的各种细胞成分的数量及功能状态与斑块稳定性关系的研究很少［3］，我们收集我院12年来125例冠心病尸检材料，应用免疫组化对斑块内各种细胞成分进行定性和定量研究， 探讨这些细胞与斑块稳定性的关系，以及各种细胞成分相互之间的作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　选取我院199201/200412间临床诊断或(和)病理证实为稳定心绞痛、不稳定心绞痛和急性心肌梗死的尸体解剖病例共125例，其中稳定心绞痛组34例，不稳定心绞痛组22例，急性心肌梗死组69例. 标记抗体有鼠抗人αsmooth muscle actin （SMA）, CD20, CD3, CD68, HLADR, mast cell tryptase （tryptase），均购自北京中山公司.

　　1.2方法

　　1.2.1取材及染色分离出所有病例之主要冠状动脉（右冠状动脉、左冠状动脉前降支和左旋支），经EDTA脱钙并取材，共取材3748块，其中稳定心绞痛组1095块，不稳定心绞痛组791块，急性心肌梗死组1862块. 常规脱水、包埋、切片并行HE染色，光镜观察区分稳定及不稳定斑块，并在每支有病变的分支挑选1个具有代表性的组织块，共143块（其中不稳定斑块89块）行免疫组织化学染色，采用北京中山公司提供的SP法，操作流程如我科常规免疫组织化学方法，CD68和tryptase两种抗体采用胰蛋白酶和微波联合处理的抗原修复法.
 
　　1.2.2图像分析［4］将斑块最易发生破裂的纤维帽肩部作为图像分析视野，采用MPIAS500病理图文分析系统对SMA标记的切片进行测量，光镜400倍下选取3个视野，测量阳性区域面积占参考面积（2577 μm2）的百分率并取其平均值作为分析指标；为提高巨噬细胞、肥大细胞和T， B淋巴细胞计数的准确性，采用目镜网格测微尺在光镜400倍下选取3个视野，以100格视野范围（6.25 μm×104.00  μm）数取所有阳性的细胞并取其平均值作为分析指标.
 
　　统计学处理： 数据以x±s表示，使用SAS软件进行t检验（t′检验）和简单相关分析， P＜0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1冠状动脉粥样硬化斑块的形态学观察在3748块冠脉斑块中，不稳定斑块为2379块，占63.5%，急性心肌梗死及不稳定心绞痛患者中大部分斑块为不稳定斑块，而稳定心绞痛患者中不稳定斑块只占0.5%. 不稳定斑块大部分为偏心性斑块，含有大的脂质坏死核心，纤维帽很薄，纤维帽内见较多的淋巴样细胞浸润，尤其在肩部（Fig 1），而稳定斑块则脂质核心很小或无，斑块由大量硬化性胶原组成，一些长梭型细胞深埋在胶原纤维内，淋巴样细胞很少.

　　2.2冠状动脉粥样硬化斑块稳定性与tryptase, CD68, SMA, CD3, CD20表达情况的关系不稳定斑块中tryptase （Fig 2）, CD68 （Fig 3）及CD3（Fig 4）的表达要明显强于稳定斑块，尤其是在纤维帽的肩部，而SMA（Fig 5）的表达正好相反，不稳定斑块内SMA阳性细胞很少，在纤维帽的肩部几乎见不到SMA阳性细胞，HLADR染色显示不稳定斑块内大部分淋巴样细胞呈阳性表达（Fig 6）.  图像分析数据表明不稳定斑块组tryptase, CD68及CD3的表达明显高于稳定组（P<0.05），而SMA的表达则明显低于稳定组（P<0.05, Tab 1）. 所有斑块内均未见CD20表达.表1稳定及不稳定冠状动脉粥样硬化斑块内细胞成分的免疫组织化学染色结果比较（略）

　　2.3SMA, CD3, CD68及tryptase表达情况间的相关性根据各免疫组化标记物之间的散点图可进一步做简单相关分析，SMA和CD68, CD3及tryptase之间均存在负相关关系（P<0.05, Tab 2）, CD68, CD3和tryptase三者之间均存在正相关关系（P<0.05）.表2免疫组化各标记物互相之间的关系（略）

　　3讨论

　　与其他器官相比，血管内细胞种类相对较少，正常冠状动脉内皮和内弹性膜之间只有很薄的内皮下层，其中含有少量纵行平滑肌细胞. 动脉粥样硬化病变的使内皮下层细胞成分逐渐增多，包括平滑肌细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞等. 资料表明斑块内细胞成分与斑块稳定性的关系非常密切［4，5］.

　　近年来国内外研究发现巨噬细胞及T淋巴细胞是不稳定斑块中的主要细胞成分，这些炎细胞多分布于偏心性斑块纤维帽最易发生破裂的肩部. 体外机械实验也证实巨噬细胞的浸润使纤维帽承受张力的能力下降而容易破裂. 我们的研究结果也证实了这一点，即斑块内巨噬细胞、T淋巴细胞及肥大细胞越多，斑块越不稳定；而且大部分浸润的T淋巴细胞表达HLADR, 表明这些细胞为活化的T淋巴细胞. 斑块内的巨噬细胞能通过其清道夫受体摄取氧化修饰的低密度和极低密度脂蛋白,这种过程不受细胞的反馈性抑制,当细胞摄取过量后则发生凋亡,最终形成脂质中心并逐渐增大. 活化的巨噬细胞和T淋巴细胞所分泌的细胞因子如白介素1 (IL1) 和肿瘤坏死因子α (TNFα) 可调节血管内皮细胞产生巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）促进单核巨噬细胞增生并使之激活［6］. 此外巨噬细胞还可通过分泌一系列蛋白溶解酶, 特别是MMPs［7］和组织蛋白酶D［4］, 消化纤维帽成分从而加速其破裂.
 
　　平滑肌细胞作为动脉粥样硬化斑块中细胞外基质（ECM）的生成者，其数量的多少与斑块稳定与否关系非常密切. 我们发现不稳定斑块纤维帽内平滑肌细胞的数量明显低于稳定斑块. 并且斑块内SMA的表达与CD68, CD3和tryptase表达间均呈负相关关系，提示我们可能斑块内巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞均对平滑肌细胞数量的减少有一定的影响. 活化的巨噬细胞和T淋巴细胞可产生多种细胞因子影响ECM合成，如IL1和TNFα与斑块内细胞毒性T淋巴细胞可杀死斑块内平滑肌细胞［7］ ，而γ干扰素（INFγ）则使平滑肌细胞增生的能力下降，国外研究发现与斑块内浸润的炎细胞密切相关的IL1β转换酶、TNF2, INFγ及抑癌因子p53等蛋白参与平滑肌细胞的凋亡［8］，从而干扰ECM正常结构的维持和修复，使斑块变得不稳定. 另外研究发现热休克蛋白通常对斑块内的平滑肌细胞起保护作用，70 ku热休克蛋白的合成随斑块内细胞毒性物质增多而减少，从而对平滑肌细胞的保护作用降低, 以致平滑肌细胞死亡, 进而炎细胞浸润加剧并降解基质使斑块破裂［9］.
    
　　肥大细胞近年来被提出来认为与斑块不稳定有密切的关系. 成熟的动脉粥样硬化斑块中的肥大细胞虽然数量上比巨噬细胞和T淋巴细胞少，但其分泌的类胰蛋白酶（tryptase）和胃促胰酶 (chymase) 不仅具有促进巨噬细胞转变为泡沫细胞的功能，并刺激巨噬细胞和平滑肌细胞分泌MMPs，此外还可作为MMPs酶原的激活剂对ECM进行降解，从而在斑块破裂过程中起重要作用［10］. 我们发现不稳定斑块中肥大细胞数量远多于稳定斑块，主要位于临近巨噬细胞和T淋巴细胞的ECM中，而且CD68, CD3和tryptase的三者之间的表达均呈明显正相关关系，说明斑块内的巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞三者之间存在相互作用，共同参与斑块的不稳定.

　　【】

　　［1］Lee RT, Libby P. The unstable atheroma ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997; 17: 1859-1867.

　　［2］韦立新，石怀银，郭爱桃. 稳定性、不稳定性心绞痛及急性心肌梗死病人冠状动脉病变的形态学差异［J］. 中华病杂志，1998；27（3）：168-170.

　　Wei LX, Shi HY, Guo AT. Morphologic discrepancies of coronary atherosclerotic lesion between patients with stable and unstabale angina plus acute myocardial infarction ［J］. Chin J Pathol, 1998; 27(3): 168-170.

　　［3］石怀银，韦立新，郭爱桃. 冠状动脉斑块中炎性细胞和平滑肌细胞的定量及其与斑块稳定性的关系［J］. 中华病理学杂志, 1999; 28（4）: 256-259.

　　Shi HY, Wei LX, Guo AT. Ｍorphologic study of inflammatory cells and smooth muscle cells in coronary plaques and the relation with the plaque stability ［J］. Chin J Pathol, 1999; 28 (4): 256-259.

　　［4］ Boyle JJ.  Macrophage activation in atherosclerosis: Pathogenesis and pharmacology of plaque rupture ［J］. Curr Vasc Pharmacol, 2005;3(1):63-74.

　　［5］  Hennerici MG. The unstable plaque ［J］. Cerebrovasc Dis, 2004;17(Suppl 3):17-31.

　　［6］ Shah PK. Mechanism of plaque vulnerability and rupture ［J］. J Am Coll Cardiol, 2003; 41(4 suppl S): S15-S22.

　　［7］郭爱桃，韦立新，石怀银. 基质金属蛋白酶1与冠状动脉粥样硬化斑块破裂的关系［J］. 中华病理学杂志, 2000; 29 (4): 263-266.

　　Guo AT, Wei LX, Shi HY. Matrix metalloproteinase1 and coronary atherosclerotic plaque rupture ［J］. Chin J Pathol, 2000;29 (4): 263-266.

　　［8］ Kavurma MM, Bhindi R, Lowe HC, et al. Vessel wall apoptosis and atherosclerotic plaque instability ［J］. J Thromb Haemost, 2005; 3(3): 465-479.

　　［9］  Johnson Ad, Berberian PA, Tytell M. Differential distribution of 70kd heat shock protein in atherosclerosis. Its potential role in arterial SMC survival ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995; 15（1）: 27-36.

　　［10］ Lindstedt KA, Kovanen PT. Mast cells in vulnerable coronary plaques: potential mechanisms linking mast cell activation to plaque erosion and rupture ［J］. Curr Opin Lipidol, 2004;15(5): 567-573.