人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达

        作者：伊正君，朱道银，李俊明，何永林，杨健，李娜

【关键词】  巨噬细胞

    Construction of a fusion gene expression vector containing human granulysin and green fluorescent protein gene and its expression in murine macrophage RAW264.7

　　【Abstract】 AIM: To clone the human granulysin from activated cytotoxic Tlymphocytes (CTL), construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of granulysin (GLS) and green fluorescent protein reporter and observe its expression in murine macrophage RAW264.7 strain. METHODS:  The coding sequence of the granulysin was amplified from the total RNA of human CTL activated by allogenic antigen after reverse transcription by NestedPCR, inserted into pEGFPC1 plasmid and then transfected RAW264.7 cells. The expression of the fusion protein and GLS was detected by fluorescence microscope and RTPCR. The immunoreactive of the product was confirmed by immunocytochemistry method. RESULTS:  The whole coding sequence of GLS was successfully amplified as expected. The accurate open reading frame (ORF) of the fusion protein recon was confirmed by PCR, endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein that was immunoreactive was successfully expressed in the targeted cells. CONCLUSION:  Human granulysin can be expressed in murine macrophage RAW264.7 strain in a fusion protein pattern and retain its immunoreactivity.

　　【Keywords】 granulysin； green fluorescent protein； macrophage； nestedPCR；immunoreactivity

　　【摘要】 目的: 克隆人天然颗粒溶素(granulysin，GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体，观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达. 方法: 提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA，经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列，插入pEGFPC1质粒，鉴定正确后转染RAW264.7细胞，采用荧光显微镜及RTPCR法检测融合蛋白及GLS的表达，采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性. 结果: 成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA，经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达，表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达，其表达产物具有良好的免疫反应性.

　　【关键词】 颗粒溶素； 绿色荧光蛋白； 巨噬细胞； 套式PCR； 免疫反应性

　　0引言

　　颗粒溶素（granulysin，GLS）对细菌、真菌、原虫、肿瘤细胞等具有很强的广谱杀伤活性，因此对其免疫杀伤作用机制的研究对于开发天然、低毒、高效的新一代杀菌制剂以及研究人体的天然免疫过程具有重要意义. 为此我们直接从激活后的人外周血单个核细胞（PBMC）总RNA中扩增出GLS的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白报告基因融合的真核表达载体，转染到鼠巨噬细胞株RAW264.7中进行了表达.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　E.coli Top10, Clontech公司质粒载体pEGFPC1为本室保存;小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自第三军医大学药教研室. 人外周血单个核细胞(PBMC)分离液及植物血凝素（PHA）购自第三军医大学试剂服务中心；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；限制性核酸内切酶BsPE I，BamH I购自NEB公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA）,高保真ProbestTaq酶、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarker DL2000等均购自大连宝生物公司； GenePorter 2真核转染试剂为美国GTS公司产品；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.

　　1.2方法

　　根据GeneBank中人GLS的cDNA序列，共设计合成了4条引物：PG1: 5′GCGCTAGCGTATCTGTGGTAAACCCAGTG3′; PG2: 5′GCGGTACCCTTGCTTGACACTTTATTCTCG3′; PGE1: 5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGAACCCAGGTCTGGTCTTCTC3′; PGE2: 5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCAGAGGGGACCTGTAGAAG3′; 全部由大连宝生物公司合成. 由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在PGE1引物设计中去除了GLS的分泌肽编码序列. 首先用PHA活化外周血单个核细胞，然后用同种异型抗原诱导、刺激其中的CTL细胞和NK细胞活化，从而启动GLS基因的转录. 方法是，无菌采集2份健康人静脉血各6 mL，肝素抗凝. 1500 r/min离心10 min，分别吸出上层血浆及白细胞层，然后用PBS缓冲液1∶1稀释白细胞，再按PBMC分离液说明，常规分离外周血单个核细胞. 取其中一份PBMC样本洗涤2次后以含100 mL/L自体血浆的完全RPMI 1640培养液重悬，调节细胞浓度为2×106/L，加入PHA使其终浓度为200 mg/L，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中，培养24 h后加入另一份样本（此样本PBMC经灭活处理后以含100 mL/L灭活小牛血清的完全RPMI 1640培养液重悬）共同培养48 h后收获细胞.

　　1.2.1GLS cDNA的扩增、克隆与测序抽提细胞总RNA，逆转录后调适相应的缓冲液，用高保真ProbestTaq酶取代试剂盒自带的HSTaq, 用引物PG1，PG2进行PCR扩增25个循环，获得包含目标序列在内的GLScDNA全长片段. 然后取产物2 μL为模板，以引物PGE1与PGE2进行套式扩增，反应条件为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环； 72℃延伸8 min. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测. 纯化后以BsPE I，BamH I双酶切、回收，与同样处理的pEGFPC1载体大片段在16℃连接1 h，转化大肠杆菌TOP10，涂布于含30 mg/L卡那霉素LB平板上培养，次日挑取卡那霉素抗性单菌落，进行PCR鉴定，阳性克隆置3 mL含30 mg/L卡那霉素LB培养基中振摇增菌，小量抽提质粒，用BsPE I与BamH I进行双酶切鉴定，送上海博亚公司测序.

　　1.2.2细胞转染及表达产物的检测RAW264.7细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，以24孔板置37℃，50 mL/L CO2培养，常规方法制作RAW264.7细胞爬片，至80%~90%汇片后按转染试剂盒说明进行转染，以pEGFPC1空质粒转染的RAW264.7细胞作为对照. 转染72 h后分别收集实验孔及对照孔的细胞:①取出爬片进行荧光检测，观察融合蛋白的表达及分布；② 以RTPCR法对GLS基因进行转录水平上的检测：抽提细胞总RNA逆转录，以PGE1, PGE2为引物，按上述条件进行扩增；③GLS表达产物的免疫学活性检测：取出爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法是：PBS洗，40 g/L多聚甲醛固定，PBS洗，30 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min； PBS洗，滴加血清封闭液，室温20 min；滴加1∶300稀释的山羊抗人GLS抗体，4℃过夜；PBS洗，滴加生物素化的兔抗山羊抗体，室温20 min；PBS洗，滴加链酶亲和素生物素酶复合物（SABC）液，室温20 min；PBS洗，DAB避光显色20 min；苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片，观察.

　　2结果

　　2.1GLS cDNA的套式PCR扩增两次PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，分别在433，754 bp处见到一特异性目的片段，与理论预测的GLS全长cDNA序列大小相符(Fig 1).

　　2.2重组质粒的PCR及酶切鉴定插入正确片段的重组菌落经PCR扩增后，电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带. 分别抽提质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳表明,酶切后产生一线性空载体条带及一条与理论预测值一致的目的片段(Fig 2).

　　2.3GLS转录产物的RTPCR检测转染72 h后抽提细胞总RNA以原引物作RTPCR重新扩增出目的片段为433 bp，与理论预测值完全相符(Fig 3).

　　2.4GLS与EGFP融合蛋白的荧光检测转染72 h后融合蛋白表达产物主要定位于细胞质(Fig 4).

　　2.5GLS表达产物的免疫细胞化学以山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗，DAB显色可见GLS呈强阳性表达(Fig 5).

　　3讨论

　　一般认为清除结核杆菌等胞内寄生菌的感染主要依赖人体的细胞免疫反应，可以运用结核杆菌的单一［1］或融合形式［2］的保护性抗原构建基因疫苗激发人体的Th1型细胞免疫反应来防治结核病. 在这一过程中，细胞毒性淋巴细胞起着关键作用. 激活的CTL细胞和NK细胞产生的GLS是一种细胞毒性免疫效应分子. Ogawa等［3］认为血清GLS的水平是评价机体细胞免疫功能状态的新指标. Kida等［4］利用拉氏无胆支原体（Acholeplasma laidlawii）刺激人单核细胞来源的THP1细胞株，在其中检测到了GLS mRNA的表达，并认为特定刺激在巨噬细胞中诱导产生GLS可能是机体一种有效的抗微生物入侵的保护机制. 利用真核表达载体（如pcDNA3.1）已经在多种真核细胞株如YT，HuT78，COS7（非洲绿猴肾细胞）中表达出了具有生物学活性的GLS［5］. 绿色荧光蛋白是目前公认较为优良的一种标记基因，与目的基因融合后不会影响表达产物的生物学活性，新近Hanson等［6］采用绿色荧光蛋白作为报告基因与GLS作C端融合，也在YT细胞中得到了成功表达，但GLS在鼠巨噬细胞中的表达迄今为止未见报道. 我们利用套式RTPCR的方法从激活的人外周血PBMC中直接扩增出了GLS的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白的融合表达载体，在体外从细胞水平检测到了其转录与表达，这说明人GLS是能够定位在小鼠巨噬细胞胞质中进行表达的，从而为后续在活体动物模型中的应用及研究其免疫杀伤机制奠定了基础.
　
　　【】

　　［1］ 骆旭东, 朱道银, 陈全, 等. 结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗免疫原性的比较［J］.第四军医大学学报,2003; 24（17）:1630-1631.

　　Luo XD, Zhu DY,Chen Q, et al.Comparison of immunogenicity of DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis Ag85B and MPT64［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24（17）:1630-1631.

　　［2］ 江山, 朱道银,蒋英,等.结核分枝杆菌Ag85BAg85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达［J］. 第四军医大学学报,2003;24（21）:1973-1975.

　　Jiang S, Zhu DY, Jiang Y, et al.Construction of fused eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and Ag85A antigens and its expression［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24（21）:1973-1975.

　　［3］ Ogawa K, Takamori Y, Suzuki K, et al. Granulysin in human serum as a marker of cellmediated immunity［J］. Eur J Immunol, 2003; 33(7):1925-1933.

　　［4］  Kida Y, Shimizu T, Kuwano K. Opposing roles of activator protein1 and CCAAT/enhancer binding protein beta in the regulation of inducible granulysin gene expression in a human monocytic cell line,THP1［J］. Immunology, 2002； 107(4):507-516.

　　［5］  Hanson DA, Kaspar AA, Poulain FR, et al. Biosynthesis of granulysin, a novel cytolytic molecule［J］. Mol  Immunol， 1999； 36(7):413-422.

　　［6］ Hanson DA, Ziegler SF. Fusion of green fluorescent protein to the Cterminus of granulysin alters its intracellular localization in comparison to the native molecule［J］. J Negat Results Biomed, 2004;3(1):2.