CLA对2型糖尿病大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及氧化应激的影响

        作者：徐文，海春旭，杨晨，李嘉琳，王鹏 

【关键词】  实验二型糖尿病

    Effect of conjugated linoleic acids on hepatic oxidative stress and hepatic mitochondrial respiratory chain enzyme activities in type 2 diabetic rats

　　【Abstract】 AIM: To observe the effect of conjugated linoleic acids on hepatic oxidative stress and enzyme activities of hepatic mitochondrial respiratory chain in type 2 diabetic (DM2) rats. METHODS:  Sixty rats were randomly divided into 3 groups: control group, diabetic (DM) group and conjugated linoleic acids (CLA) treatment group. DM2 rat model was induced by feeds of higher sugar, fat and cholesterol with the injection of streptozotocin. Blood glucose was determined by a blood glucose testing instrument and serum insulin by a radioimmunological method. The contents of malondialdehyde (MDA), reduced glutathione（GSH） and the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in hepatic tissues were tested by biochemical methods. The enzyme activities of hepatic mitochondrial respiratory chain were measured by Clark oxygen electrode. RESULTS:  Compared with those in control group, the blood glucose, serum insulin and MDA in liver increased significantly (P<0.05) and GSH content, activities of SOD, and CAT as well as mitochondrial respiratory chain enzymes in the hepatic tissues decreased remarkably (P<0.05) in the DM group. In CLA treatment group, the indexes above ameliorated to different degree and these changes were in a dosedependent manner. CONCLUSION:  CLA ameliorates the energy metabolism impairment of DM liver by suppressing the oxidative stress and improving the activity of enzymes in mitochondrial respiratory chain, and CLA has effective protection from the oxidative injury induced by DM.

　　【Keywords】 conjugated linoleic acids; type 2 diabetes; respiratory chain enzymes；oxidative stress

　　【摘要】 目的：观察共轭亚油酸(CLA)对2型糖尿病(DM2)大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及肝内氧化应激（OS）的影响. 方法：将60只SD大鼠随机分为阴性对照组，DM组和CLA组. 高糖、高脂及高胆固醇饲料诱导胰岛抵抗联合ip链脲佐菌素建立大鼠DM2模型. 血糖仪检测血糖浓度，放免法检测血清胰岛素水平，生化法测定肝组织丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽（GSH）含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性，Clark氧电极法观察大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性. 结果：成功诱导大鼠DM2模型，与对照组比，DM组大鼠血糖浓度、血清胰岛素水平、肝脏MDA含量明显升高(P<0.05)，同时肝脏线粒体呼吸链酶活性以及抗氧化酶活性(SOD，CAT)及GSH显著降低(P<0.05)，与DM组相比，CLA治疗组大鼠以上各项指标均有改善，并存在一定的剂量效应关系. 结论：CLA通过抑制氧化应激增强大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性改善了DM大鼠肝脏的能量代谢障碍，对DM引起的氧化损伤有保护作用.

　　【关键词】 共轭亚油酸；实验二型糖尿病；呼吸酶；氧化应激

　　0引言

　　共轭亚油酸（conjugated linoleic acid， CLA）是天然存在具有共轭不饱和双键的脂肪酸，具有抑制肿瘤的形成、调节脂肪代谢、抗动脉粥样硬化、改善免疫功能、降低胆固醇、促进生长等多种生物活性. 提高胰岛素对骨骼肌的作用［1］. 2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，DM2）是一种以氧化应激为特征的病变，其线粒体氧化磷酸化能力受到损害，只有正常人的55％［2］. CLA对DM2线粒体呼吸酶活性影响研究尚未见报道. 我们使用高糖、高脂及高胆固醇饲料诱导胰岛抵抗联合ip链脲菌素建立大鼠DM2模型，观察CLA对DM2大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及氧化应激的影响，探讨CLA在预防和治疗DM方面可能存在的机制和应用前景.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性二级SD大鼠60只，体质量（280±25.3）g，由第四军医大学实验动物中心提供. 共轭亚油酸(顺9位、反11位CLA，37.1%； 反10位、顺12位CLA，37.5%； C18:1, 10.11%；C18:0，2.04%)， 由青岛澳海生物有限公司提供. 硫代巴比妥酸（TBA）、丙二醛（MDA）标准品系Merk公司产品；磷钨酸（AR）、牛血清白蛋白由Boehringer公司分装；盐酸羟胺（AR）由天津化学试剂一厂生产；NBT、苯二醛OPT(Ophenaldehyde)购自华美公司；GSH标准、TritonX100由上海化学试剂有限公司提供；链脲菌素（STZ）购自Sigma公司；胰岛素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；血糖仪（美国强生稳步倍增加型）；UV3000双波长双光束分光光度计（岛津公司）；722型光栅分光光度计（上海仪器总厂）；CPS1A超声粉碎仪（上海超声波仪器厂）； GL20A全自动高速冷冻离心机（湖南仪器仪表离心机厂）；SP2溶氧测定仪（上海植物生理研究所）；SHZ881台式水浴恒温震荡器（江苏太仓鹿河生化仪器厂）.

　　1.2方法

　　将动物随机分为阴性对照组、DM组、CLA治疗组，其中CLA治疗组又分为3个不同剂量组. 阴性对照组给予普食，DM组、CLA治疗组给予高糖高脂饮食(普通饲料加200 g/kg蔗糖、100 g/kg猪油、50 g/kg胆固醇)，喂养4 wk后将大鼠空腹8 h后自尾静脉取血，测空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，血清胰岛素水平(serum insulin level, SIL)，胰岛素敏感性指数［ISI=In(1/FBG×SIL)］确定产生胰岛抵抗，一次性30 mg/kg链脲菌素(STZ) ip，1 wk后测禁食血糖，以禁食血糖≥16 mmol/L伴胰岛素抵抗为标准判定DM2大鼠模型成功［3］. 成模后对CLA治疗组每日固定时间以0.4，0.8和1.6 g/kg CLA灌胃, 阴性对照组和DM组给予相同剂量的生理盐水灌胃，共4 wk. 第9周末处死大鼠，取血分离血清，取肝脏一部分用生理盐水制成200 g/L的组织匀浆、1000 r/min离心10 min，取上清测定MDA，GSH含量和SOD，CAT的活性以及总蛋白的含量，一部分肝组织用来分离提取线粒体，测定线粒体呼吸链酶活性. 造模期间在大鼠空腹8 h后自尾静脉取血，测定血糖浓度及血清胰岛素含量，计算ISI. MDA测定采用八木国夫荧光法; GSH测定采用荧光法; SOD测定采用改良的盐酸羟胺法; CAT活性测定用改良比色法; 线粒体呼吸链酶活性测定用Clark氧电极法［4］. 按Kesavulu等［5］方法分离线粒体.Lowrys法测定线粒体悬液蛋白量，并根据肝组织质量计算出每克肝组织的线粒体含量. 分别测定3个氧化酶活性：①NADH氧化酶(NADHOX)：10 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.4，2 mmol/L NADH；②琥珀酸氧化酶(SUCOX)：80 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.4，5 mmol/L琥珀酸，5 μmol/L鱼藤酮；③细胞色素氧化酶(CYTOX)：10 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.4，5 mmol/L 抗坏血酸，2.7 mmol/L四甲基对苯二胺，5 μmol/L抗霉素A.

　　统计学处理： 结果采用x±s表示，统计软件SPSS 11.0，Tab 1数据采用重复测量设计的方差分析，其余数据用Oneway ANOVA进行分析，P<0.05表示有显著性差异.

　　2结果

　　DM模型组大鼠经高糖高脂饮食1 mo后血糖较对照组有不同程度的升高，血胰岛素较对照组则有显著升高. ISI，发现有胰岛素敏感性降低，说明高糖高脂饮食已成功诱导出胰岛素抵抗. 注射STZ后1 wk，各DM组血糖明显上升(P<0.01)到DM标准，而血胰岛素则下降至与Ａ组相当水平(Ｐ>0.05)，计算ISI，胰岛素抵抗继续存在(Ｐ<0.01)，表明成功诱导了大鼠DM2模型. 实验6，9 wk末，单纯DM组血糖仍保持在较高水平，而各组间血胰岛素差异则无统计学意义，经CLA后血糖降低，0.8 g/kg CLA治疗4 wk及1.6 g/kg CLA治疗1 wk降低血糖更好(Ｐ<0.05)，有剂量效应趋势(Tab 1).表1CLA治疗后空腹血糖、胰岛素和胰岛素敏感指数（略）

　　2.1肝组织MDA, GSH水平及SOD, CAT活性CLA治疗4 wk后DM大鼠肝组织中MDA含量与对照组相比显著升高，GSH，SOD，CAT的水平与对照组相比显著降低，经CLA治疗后上述指标均有不同程度的改善，随着CLA剂量增加，肝脏组织中MDA含量降低更显著，使GSH，SOD和CAT的水平明显升高，有剂量效应趋势(Tab 2).表2CLA治疗4 wk DM大鼠肝组织MDA, GSH及SOD, CAT的活性（略）

　　2.2肝组织线粒体呼吸链酶活性CLA治疗4 wk后DM大鼠肝组织线粒体呼吸链酶NADHOX，SUCOX及CYTOX活性显著降低(Ｐ<0.01，Ｐ<0.05)，CLA治疗后提高，其中0.04 g/kg CLA治疗组对NADHOX，CYTOX活性有显著提高(Ｐ<0.05)，对SUCOX的活性没有明显改变，0.8 g/kg CLA治疗组对NADHOX，CYTOX活性有显著提高(Ｐ<0.01)，对SUCOX的活性也没有明显改变，1.6 g/kg CLA治疗组对NADHOX，CYTOX活性有显著提高(Ｐ<0.01)，对SUCOX的活性也有明显提高(Ｐ<0.01)，有剂量效应趋势. 值得注意的是1.6 g/kg CLA治疗组使NADHOX，SUCOX和CYTOX活性基本恢复到正常对照组的水平(Tab 3).表3CLA治疗4 wk后DM大鼠肝组织线粒体呼吸链酶活性（略）

　　3讨论

　　近年研究［5,6］发现DM动物及人体出现明显的氧化损伤和自由基介导的过氧化作用，生物大分子氧化损伤产物增加，抗氧化酶系修复损伤的缓冲能力降低. 因此我们观察CLA对DM2大鼠氧化应激水平和肝组织线粒体呼吸酶的活性的影响，旨在探讨DM2发病的分子机制确定研究靶位. 本实验证实CLA确有降低血糖的作用，显示出剂量效应趋势. 肝组织线粒体MDA, GSH水平及SOD, CAT活性变化，可以反映CLA是否通过对抗自由基而发挥其治疗作用. 本实验表明DM大鼠肝组织中MDA含量与对照组相比显著升高，GSH，SOD和CAT的水平与对照组相比显著降低，说明DM大鼠处在严重的氧化应激状态，经不同剂量CLA治疗后对上述指标均有不同程度的改善，随着CLA剂量的增加，能更加显著降低肝脏组织中MDA的含量，使GSH，SOD和CAT的水平明显升高. DM大鼠肝组织线粒体呼吸链酶NADHOX，SUCOX，CYTOX的活性与对照相比显著降低(Ｐ<0.01，Ｐ<0.05)，经CLA治疗后得到提高，具有剂量效应趋势. 值得注意的是1.6 g/kg CLA治疗组使NADHOX，SUCOX和CYTOX活性基本恢复到正常对照组的水平. 表明DM对线粒体呼吸酶NADHOX和CYTOX活性的影响尤为重要. 因此CLA有可能通过抑制DM产生的氧化应激对线粒体的损伤作用，增强大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性，改善了DM大鼠肝脏的能量代谢障碍，从而有效降低血糖，对DM引起的氧化损伤起到保护作用.

　　【】

　　［1］ Ryder JW， Portocarrero CP， Song XM，et al. Isomerspecific antidiabetic properties of conjugated linoleic acid improved glucose tolerance, skeletal muscle insulin action, and UCP2 gene expression ［J］. Diabetes,2001;50(5):1149-1157.

　　［2］ Turko IV, Murad F. Quantitative protein profiling in heart mitochondria from diabetic rats［J］. Biol Chem, 2003; 278(37):35844-35849.

　　［3］ 郭啸华,刘志红,李恒,等. 实验性2型糖尿病大鼠模型的建立［J］. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2000;9(4):351-355.

　　Guo XH，Liu ZH，Li H, et al. The rat model of experimental type 2 diabetes ［J］. J Nephropathy Dial Kidney Transplant, 2000;9(4):351-355.

　　［4］ Estabrook RW. Oxidative and phosphorylation methods in enzymology［M］. New York: Academic Press, 1967:45-51.

　　［5］ Kesavulu MM, Rao BK, Giri R, et al. Lipid peroxidation and antioxidant enzyme status in Type 2 diabetics with coronary heart disease［J］. Diabetes Res Clin Pract, 2001;53(1): 33-39.

　　［6］ Mamdouh M, Anwar UU, Ueki AR, et al. Oxidative stress in streptozotocininduced diabetic rats: Effects of garlic oil and melatonin［J］. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2003; 135(4): 539-547.