桃儿七提取物对人乳腺癌MCF
【关键词】 乳腺癌
Effects of Taoerqi extract on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma cell line MCF7
【Abstract】 AIM: To investigate the effects and related mechanism of Taoerqi on the proliferation inhibition and onset of apoptosis in breast carcinoma cell line MCF7. METHODS: Antiproliferative effect of Taoerqi extract against MCF7 was tested by MTT assay, morphologic changes of MCF7 were observed by inverted microscope, electron microscope and HE staining, and cell apoptosis percentage and cell cycle phase distribution of MCF7 were measured by flow cytometric assay. The expressions of proliferation and apoptosisassociated proteins were determined by immunocytochemical method. RESULTS: A timedependent and dosedependent proliferation inhibition was demonstrated in Taoerqi extract. With the Taoerqi extract treatment of 1, 2 and 3 mg/L for 72 h, the inhibitory rate was 43.0%, 54.9%, 78.5% respectively. The characteristic morphological changes of apoptosis were observed in cells after treated by 2 mg/L of Taoerqi, and many multinucleate giant cells were also found. Taoerqi induced a G2/M cell cycle arrest and the apoptosis was time and dosedependent. With the treatment of 2 mg/L Taoerqi for 48 h, the protein expressions of PCNA and Bcl2 decreased from (154.78±0.16) and (85.56±0.09) to (78.46±0.15) and (40.43±0.07) (P<0.01), while p21WAF1/CIP1 and cMyc increased from (92.32±0.12) and (114.48±0.14) to (125.54±0.09) and (156.52±0.08) (P<0.01). CONCLUSION: The timedependent and dosedependent proliferation inhibitory effect of Taoerqi extract on breast cancer cells appears to be caused by the upregulation of p21WAF1/CIP1 expression, downregulation of PCNA expression, and the apoptosis is related to the downregulation of antiapoptotic protein Bcl2 and the upregulation of cMyc protein. G2/M arrest is also associated with apoptosis.
【Keywords】 Taoerqi; breast neoplasm; human breast carcinoma cell lines MCF7; apoptosis
【摘要】 目的:研究桃儿七对人乳腺癌MCF7细胞增殖抑制和促进凋亡的作用,探讨其抗癌作用的机制. 方法:应用MTT法检测桃儿七提取物对人乳腺癌MCF7细胞的生长抑制作用，倒置显微镜、HE染色及电镜观察细胞形态学改变，FCM分析细胞周期及凋亡率，免疫细胞化学法检测细胞增殖凋亡调控相关蛋白的表达. 结果:桃儿七提取物可明显抑制MCF7细胞的增殖，1，2，3 mg/L桃儿七作用72 h后，细胞生长抑制率分别为43.0%，54.9%，78.5%，抑制作用呈时间及浓度依赖性.形态学观察到用药后凋亡细胞典型的形态学特征，伴有多核细胞形成.FCM分析发现桃儿七阻断MCF7细胞生长于细胞周期的G2/M期，凋亡诱导作用呈时间及浓度依赖性.免疫细胞化学结果显示，2 mg/L桃儿七作用48 h后，PCNA，Bcl2蛋白表达分别由154.78±0.16，85.56±0.09降至78.46±0.15，40.43±0.07，P<0.01；而p21WAF1/CIP1和cMyc蛋白由92.32±0.12，114.48±0.14增至125.54±0.09，156.52±0.08，P<0.01. 结论:桃儿七提取物对人乳腺癌MCF7细胞的生长有明显的呈时间及浓度依赖性的抑制作用,G2/M期阻滞并诱导凋亡. 该作用与p21WAF1/CIP1表达增加及PCNA表达降低有关，通过下调Bcl2和上调cMyc表达诱导乳腺癌细胞凋亡.
【关键词】 桃儿七;乳腺癌;人乳腺癌细胞系MCF7;凋亡
0引言
藏药桃儿七又名小叶莲，藏药音译奥色塞，习用果实. 宗玉英等［1］发现桃儿七果实900 mL/L乙醇提取物对肿瘤细胞抑制率为75%,目前对于其抗肿瘤作用机制仍不很清楚. 我们对桃儿七根900 mL/L乙醇提取物抑制乳腺癌细胞增殖及其诱导凋亡的作用机制进行研究如下.
1材料和方法
1.1材料
乳癌细胞MCF7由第四军医大学分子生物学室惠赠. 小牛血清，RPMI 1640培养基（Gibco公司）;噻唑蓝（MTT，上海生工生物制品公司）;二甲基亚砜（DMSO）;p21WAF1/CIP1，cMyc，Bcl2，PCNA鼠抗mAb，SABC及DAB试剂盒（博士德公司）. 酶标仪（奥地利Tecan）;相差倒置显微镜（Olympus CK4032RPC）;流式细胞仪（美国Coulter Elite Esp型）;投射电镜（JEM2000EX 日本）. 取桃儿七根粗粉100 g，以石油醚（30~60℃）浸提至无色，药渣再以900 mL/L乙醇浸提至无色，乙醇回收溶剂，减压蒸馏获得浸膏，真空低温干燥，制得样品.样品先以少量DMSO溶解，然后用双重蒸馏水稀释配制为20 mg/mL的原液，用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌后-20℃避光保存，临用前再以RPMI 1640完全培养基稀释配成不同药物浓度，DMSO在溶液中最大浓度小于0.05%.
1.2方法
1.2.1细胞生长状态取对数生长期细胞常规消化接种于96孔培养板（3×103个/孔），每孔200 μL，培养24 h后弃去培养液，随机分为5组(每组n=8)，实验组加入含不同浓度桃儿七根乙醇提取物的RPMI 1640完全培养基200 μL，终浓度为（1，2，3 mg/L）；阴性对照组加等量RPMI 1640培养液；阳性对照组为顺铂（PDD） 3 mg/L.分别于加药后24，48和72 h加入MTT (5 g/L) 20 μL继续培养4 h，弃培养液，每孔加150 μL DMSO，设置空白对照，振荡混匀10 min,上酶标仪检测A值，检测波长490 nm，波长640 nm.抑制率(%)=（1-实验组A/对照组A）×100. 倒置显微镜动态观察细胞形态变化.取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于置有载玻片的6孔板培养皿，细胞贴壁后弃上清，用药组加入含2 mg/L桃儿七的RPMI 1640的培养液共孵育，同时设对照组，48 h后行常规HE检查.再将6×105经2 mg/L桃儿七作用后24 h及48 h的MCF7细胞浸入4℃冰冷的40 g/L戊二醛固定2 h，用探针剥离细胞团块，移入小瓶，常规电镜脱水，包埋，双铅染色，制备超薄切片，染色，透射电镜观察细胞超微结构.
1.2.2细胞周期及凋亡取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于50 mL培养瓶(3×105个/瓶)，24 h后实验组加入含不同浓度桃儿七根乙醇提取物的培养液，对照组以等量RPMI 1640代替样品，常规培养，分别于加药后24，48 h常规消化，10 mmol/L PBS洗涤离心两次，取1×106个细胞，70 mL/L冷乙醇固定过夜，再用PBS洗去固定液，加碘化丙啶(PI)染色液1 mL(含0.25 g/L RNase A，20 mg/L PI)，置于4℃冰箱30 min后上流式细胞仪检测DNA含量，每组共测1×104个细胞.同时取1×106个细胞重悬于预冷的结合缓冲液，调整细胞数为1×109/L，加入5 μL Annexin VFITC和5 μL PI到490 μL细胞悬液中，4℃避光孵育10 min，流式细胞仪检测荧光强度，每组共测1×104个细胞.
1.2.3免疫组化取对数生长期细胞，调整细胞密度接种于置有载玻片24孔板的培养皿，实验组加入含2 mg/L浓度桃儿七根90 mL/L乙醇提取物，对照组加等量1640培养液，常规培养，于加药后48 h终止培养，取出爬有细胞的玻片，10 mmol/L PBS冲洗3次，950 mL/L乙醇固定15 min，染色步骤严格按SABC，DAB试剂盒说明书操作，以PBS代替一抗作阴性对照，检测Bcl2，cMyc，PCNA及p21WAF1/CIP1蛋白表达.染色结果判断：MCF7细胞核或(和)胞质呈棕褐色为阳性，高倍视野下随机计数5个视野细胞总数，计数其中的阳性细胞，算出阳性率,并用病理图像分析软件对蛋白表达进行半定量分析.
统计学方法：计量资料用x±s表示，计数资料用％表示，采用SPSS 10.0统计软件包作数据处理，分别采用秩相关分析，方差分析，t检验.P<0.05表示差异有统计学意义.
2结果
2.1桃儿七对MCF7细胞生长的抑制作用对照组MCF7细胞体外生长活跃，桃儿七对MCF7细胞有明显的抑制作用，1 mg/L 48 h出现细胞生长抑制，与对照组比较有统计学意义(P<0.01)，而2和3 mg/L 24 h出现极显著的差异（P<0.01），并且随着作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降，并呈时间、浓度依赖性,经秩相关分析γs=0.75，P<0.05. 1，2，3 mg/L桃儿七作用72 h后，细胞生长抑制率分别为43.0%，54.9%，78.5%，阳性对照组PDD 3 mg/L为58.6%（Tab 1）.表1桃儿七对MCF7细胞的影响（略）
2.2肿瘤细胞形态学变化加桃儿七后细胞膜皱缩，细胞先变圆,原来贴壁生长的细胞脱离生长面，呈悬浮状态，且随药物浓度增大及时间延长，细胞悬浮增多.HE染色后光镜下凋亡细胞核呈致密深蓝色，核浓缩，核染色质固缩致密或断裂（Fig 1），另有部分细胞体积变大，出现较多多核细胞,并有多级分裂出现.用药24 h后,透射显微镜下可见凋亡细胞膜表面微绒毛减少或消失，核染色质边集及凝聚，核形态不规则，线粒体结构基本清晰，有些内质网空泡变形，另有许多多核细胞（Fig 2），48 h后，部分胞核染色质固缩沿核膜分布，有的核膜部分消失，另见坏死细胞.
2.3细胞周期分布桃儿七作用24 h后MCF7细胞明显阻滞在G2/M期，并呈浓度依赖性，而G0/G1, S期明显减少（Tab 2）；2 mg/L桃儿七作用细胞48 h，S期细胞逐渐增多，增殖渐趋活跃，G2/M期细胞仍高，G0/G1期仍低.表2桃儿七作用24 h后FCM检测细胞周期（略）
2.4细胞凋亡桃儿七有诱导细胞凋亡作用. 药物作用24 h后，Annexin V+细胞及Annexin V/PI双阳细胞逐渐增加.48 h后对照组Annexin V+细胞为0.2%，Annexin V/PI双阳细胞为1.0%，2 mg/L桃儿七组Annexin V+细胞为23.1%，Annexin V/PI双阳细胞为15.3%，说明随着药物浓度增高及作用时间的延长，早期凋亡细胞及继发性坏死细胞均增加（Tab 3）.表3桃儿七作用24 h Annexin V/PI双染色结果（略）
2.5免疫组化MCF7细胞中PCNA，p21WAF1/CIP1，cMyc蛋白表达定位于胞核，Bcl2蛋白表达定位于细胞质，细胞均100%阳性表达. 2 mg/L桃儿七作用于细胞48 h后，PCNA（Fig 3）, Bcl2表达下降，cMyc，p21WAF1/CIP1蛋白表达增加（Tab 4）,与对照组相比,有统计学意义(P<0.01).表4桃儿七对PCNA,p21WAF1/CIP1,cMyc,Bcl2蛋白表达影响（略）
3讨论
桃儿七果实乙醇提取物对多种肿瘤细胞具杀伤作用［1］，但其抗肿瘤机制不明. 本结果表明，桃儿七对MCF7细胞有明显的抑制作用，并呈时间、浓度依赖性. 桃儿七还有G2/M期阻滞作用及凋亡诱导作用. 许多研究显示G2M期阻滞与凋亡有关［2］. 桃儿七可引起细胞出现凋亡，肿瘤主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少［3］. Bcl2是公认的抗凋亡基因，多种肿瘤高表达Bcl2,并通过Bcl2发挥抗凋亡作用［4］. cmyc基因表达产物具有双向性，其引起的细胞凋亡可被Bcl2的过表达所抑制.ICC结果显示，2 mg/L桃儿七作用于细胞48 h后，Bcl2蛋白表达下调，cMyc蛋白表达上调，说明下调Bcl2蛋白表达及上调cMyc蛋白表达可能为桃儿七诱导MCF7细胞凋亡的机制之一. PCNA不仅参与DNA的合成，而且与cyclin，CDK，p21形成四聚体，调控周期和增殖，其表达高低可作为细胞增殖的指标［5］.
p21WAF1/CIP1是p53下游的调节基因，最近研究表明G2/M节点的改变也与p21WAF1/CIP1的表达有关［6］.ICC结果显示，2 mg/L桃儿七作用于细胞48 h后，与对照组相比，PCNA蛋白表达下调，p21WAF1/CIP1蛋白表达上调，这可能为桃儿七抑制MCF7细胞增殖抑制的机制之一. 本实验对桃儿七抗肿瘤作用机制及其开发利用提供了一定的理论依据.
【】
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