持久稳定的大鼠→小鼠造血嵌合体模型的建立
【关键词】 骨髓移植
Establishment of stable rat→mouse hematopoietic chimera model
【Abstract】 AIM: To establish a stable animal model of hematopoietic chimerism. METHODS: Conditioned SD rats received bone marrow cells from BALB/c mouse to induce xenogeneic chimeric rats. Thirty days later, lethally irradiated BALB/c mice received bone marrow cells from chimeric rats and their survival rate was monitored daily. Recipients splenic cells were stimulated in mixed lymphocyte culture (MLC) with xenoantigen and skin transplantation was carried out on day 30. RESULTS: Acute graft versus host disease was significantly alleviated, the survival time was prolonged and T cell proliferation was inhibited. More stable xenogeneic chimerism over 90 d was achieved via reverse bone marrow transplantation. CONCLUSION: A longterm xenogeneic chimera model is established by transplanting bone marrow cells of chimeras.
【Keywords】 chimera model; wholebody irradiation; bone marrow transplantation
【摘要】 目的： 建立持久稳定的造血嵌合体模型. 方法： 将预处理后的SD大鼠经尾静脉注射BALB/c小鼠骨髓细胞，诱导形成特异性耐受的嵌合体SD大鼠. 30 d后，再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给致死性照射后的BALB/c小鼠，监测小鼠的存活率，移植后30 d做皮片移植和混合淋巴细胞培养，观察小鼠嵌合率的变化. 结果： 嵌合体模型小鼠仅有轻度移植物抗宿主病的表现，生存期明显延长，移植后嵌合率较稳定，移植皮片存活期延长，与对照组相比有显著性差异. 结论： 通过输入嵌合体骨髓的方法可建立稳定持久的大鼠→小鼠嵌合体模型.
【关键词】 嵌合体模型；全身照射；骨髓移植
0引言
大鼠→小鼠的骨髓移植，通过对受体进行强烈的清髓性预处理或注射大量骨髓以获得可靠植活，但异种移植物抗宿主病（XGVHD）较强，且嵌合状态随时间延长逐渐消失. 为建立稳定的异种造血嵌合体，我们研究了协调性动物（大鼠小鼠）的骨髓移植模型，因为他们之间不存在天然的抗体，对异种移植物不会发生超急排斥(hyperacute rejection, HAR). 先对供者进行预处理，使其产生对小鼠的特异性耐受，再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给小鼠. 由于此前嵌合体大鼠已对小鼠产生了特异性耐受，故将此耐受的骨髓植入小鼠体内可明显减轻XGVHD，并诱导出持久稳定的嵌合状态.
1材料和方法
1.1材料
SD大鼠(SPF级)8只，雌性，8～10周龄. C57BL/6(H2b)小鼠6只，雌性，8～10周龄. BALB/c(H2 d)小鼠40只（包括在MLR和病理检查中处死的小鼠，不编入各组计数），雌性，8～10周龄，均购自第一军医大学实验动物中心,并饲养在清洁实验动物中心层流仓. PE标记的抗小鼠H2DdmAb(PharMingen公司)；FITC标记的抗大鼠MHCCLASSⅠmAb(Serotec公司)；3HTdR（原子能研究所）；60Co照射源(广东省辐照中心)；流式细胞仪（FACScan; Becton Dickinson）；自动液闪计数器（Beckman, USA）.
1.2方法
1.2.1嵌合体模型的建立SD大鼠于术前5 d开始饮含红霉素(250 mg/L)和庆大霉素(320 mg/L)的抗生素溶液. 无菌条件下取BALB/c小鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液, SD大鼠接受8Gy（照射率0.5 Gy/min）全身照射(TBI)后4 h内经尾静脉输入BALB/c小鼠骨髓细胞2×108/只,48 h后腹腔注射环磷酰胺50 mg/kg［1］. 30 h后检测外周血嵌合率为37.39%~47.26%，证实小鼠源性骨髓已在大鼠体内植活. 取上述嵌合体SD大鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液,BALB/c小鼠肠道净化后接受9 Gy全身照射，随即经尾静脉输入上述嵌合体骨髓细胞4×107/只.
1.2.2实验分组以BALB/c小鼠为受鼠的A, B, C, D, E组，均接受9 Gy的TBI预处理： A组（8只）输注正常SD大鼠的骨髓细胞; B组（8只）输注嵌合体SD大鼠的骨髓细胞;C组（6只）为自体移植组，D组（6只）为预处理组，不输注骨髓. 以无关第3者B6小鼠为受鼠的E组（6只）输注嵌合体SD大鼠的骨髓细胞.
1.2.3组织病理检查出现移植物抗宿主病表现的小鼠,濒死前活杀,B组存活者于移植后第60日处死，取其肝、小肠和皮肤标本,以100 mL/L甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察. 按Thomas GVHD病理组织学分级标准判定［2］.
1.2.4嵌合率的测定取移植后小鼠外周血,加入FITC标记的 抗大鼠MHCCLASSⅠmAb(每1×106细胞中加入1 μg),避光,4℃, 30 min. 红细胞裂解液去掉红细胞,PBS洗涤2次,流式细胞仪检测嵌合率.
1.2.5皮肤移植及存活情况的观察［3］的方法,每日观察皮毛,如变硬或脱落视为移植排斥,柔软或鼠毛生长视为移植存活.
1.2.6混合淋巴细胞反应（MLR）移植后30 d，分别取A,B组小鼠与正常BALB/c小鼠的脾细胞为反应细胞，以正常SD大鼠与Whistar大鼠脾细胞为刺激细胞，做混合淋巴细胞反应（MLR），丝裂霉素灭活刺激细胞，于96孔培养板每孔加反应细胞4×105个和刺激细胞2×105个，设自体反应孔，每组3复孔，培养96 h，终止培养前18 h，每孔加入3.7×104 Bq（中国原子能研究所），液闪计数器测定，结果用Bq值x±s表示.
统计学处理： 实验所得数据以x±s表示, 采用SPSS12.0软件进行数据分析. 用KaplanMeier估计与绘制生存曲线,用方差分析比较各组脾细胞增殖程度的差异，组间多重比较用LSD法，用秩和检验分析各组移植皮片的存活期，用t检验分析外周血白细胞计数和嵌合率.
2结果
2.1嵌合体模型的生存期A组在BMT后1 wk内出现体质量下降弓背体位、活动度差、毛脏乱等典型GVHD表现，第5日开始死亡并持续下去，仅25%存活超过60 d. B组出现轻微的GVHD, 62.5%存活，与A组比较有显著性差异（Log Rank法比较，P<0.05）. C组均存活，D组均在BMT后10 d内死亡. 用KaplanMeier评估生存曲线 (Fig 1)显示嵌合体骨髓细胞的输入可显著延长存活期，GVHD发生率及严重度降低. E组也出现严重GVHD 表现，60 d时存活率仅16.67%.
2.2移植皮肤存活情况BALB/c小鼠对特异供体SD及无关第三者Wistar皮肤的存活情况. 经秩和检验KruskalWallis H法分析，P=0.01，经多重比较，B组BALB/c小鼠对SD大鼠皮肤移植物的存活时间比A组明显延长（Tab 1, P<0.05）, 但对Wistar大鼠皮肤移植物均在2 wk内排斥，与对照组（系天然BALB/C小鼠）比较无显著性差异(P>0.05).表1BALB/c小鼠异种皮肤移植物的存活情况（略）
2.3混合淋巴细胞反应移植第30日A组与B组小鼠脾细胞对供体SD大鼠脾细胞的单向混合淋巴细胞反应明显降低，经方差分析和LSD法的多重比较检验，与正常BALB/c小鼠相比P<0.001， B组脾细胞增殖的抑制程度与A组有显著差别（P<0.05）. 移植后60 d的混合淋巴细胞培养结果与30 d时一致.
2.4嵌合率测定第30日时测定嵌合体模型的外周血嵌合率（Tab 2），经t检验B组外周血嵌和率与A组比较无显著性差异. 但随着时间推移，嵌合率逐渐下降， A组下降幅度较大，90 d时A组仅 为(12.40±0.32)% ，B组嵌合率仍有(23.77±4.50)% (P<0.05,因A组死亡率高，故嵌合率的样本数较少）. B组造血恢复时间明显缩短，从第9日起外周血白细胞计数始终比A组高(Tab 3)，显示反向BMT促进受者造血的重建.表2BMT后30, 60, 90 d时A, B组小鼠外周血中大鼠源性细胞的比例（略） 表3BMT后30 d内A, B组小鼠外周血白细胞计数（略）
2.5病理分析A,E组死亡小鼠病改变符合GVHD病理变化. 表现为： ① 皮肤： 基底细胞空泡变性、溶解坏死,大量淋巴细胞浸润；② 肝脏： 肝细胞呈不同程度的变性或坏死,汇管区有较广泛淋巴细胞浸润；③ 小肠： 肠黏膜水肿和出血, 部分糜烂,小肠绒毛坏死脱落. 黏膜下层淋巴细胞浸润. 病理改变属于GVHDⅡ～Ⅲ级. B组小鼠病理改变明显轻于A,E组,仅为轻度炎症反应，少量散在的肝细胞水肿变性，轻度小肠绒毛变钝，隐窝再生性改变，此为GVHDⅠ级.
3讨论
异种移植的排斥反应包括HAR，急性血管排斥(AVR)以及急性细胞排斥(ACXR). AVR主要以纤维蛋白沉积、出血和血栓导致的广泛缺血缺氧和器官衰竭为特征，血管是受攻击的主要目标，在肾移植中与肾小球血栓型微血管病有关［4］. 关于ACXR发生的确切机制尚存在某些不确定因素，在灵长类动物体内，由CD4+和CD8+ T细胞共同介导抗猪的免疫反应，NK细胞也起重要的细胞毒作用，异种器官排斥期间发现有细胞性浸润［5］. 实际上,异种移植的细胞免疫反应的程度很强,现有的免疫抑制剂能抑制同种异体移植的排斥反应，但不足以控制严重的异种排斥，并且导致长期的免疫缺陷，移植物排斥和病毒复制的激活［6］；因此,许多学者认为异种移植的关键是要诱导对异种抗原的特异性免疫耐受.
利用造血嵌合体诱导供者特异性的耐受被认为是避免排斥较理想的方法. 它允许供者和受者骨髓来源的树突细胞移入胸腺，代表供者和自身抗原，并诱发针对激活的T祖细胞的阴性选择，随即对同一供者来源的固体器官也产生耐受，而对第3者则排斥. Mohiuddin等［7］给大鼠11Gy致死性照射后，输注处理过的骨髓诱导小鼠→大鼠完全嵌合体模型，随后行供体特异性心脏移植，移植物存活时间明显延长. 此外，还有许多实验显示在混合嵌合体中可诱导供者器官长期存活［8-10］. 异种移植物抗宿主病（XGVHD）是建立异种造血嵌合体的一个主要障碍，它与同种GVHD有一定的区别,主要是细胞免疫反应很强，XGVHD更为严重，异种组织和器官较同种更难植入；异种供体细胞在受者体内的浸润和分布的部位、程度与同种不同，主要分布于淋巴造血组织及供者淋巴母细胞扩增部位［11，12］.
目前，关于大鼠→小鼠BMT模型的报道较多,建立稳定的嵌合体模型是诱导和维持供体特异耐受的重要途径. 我们通过反向移植嵌和体骨髓的方法先使供者对受者抗原产生特异性的免疫耐受，对受者抗原不产生免疫应答，从而突破异种间的免疫屏障，明显减轻了XGVHD的发生率及严重度，促进造血重建，并能够长时期维持较高的嵌合状态和供体特异性耐受. 这些结果证明了我们建立的异种造血嵌合体模型是成功的.
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