水浸束缚应激对大鼠下颌下腺内瘦素表达的影响
作者：赵豫凤，刘广忠，杨加周，苗乃周
【关键词】 应激；水浸束缚；颌下腺；瘦素；大鼠
Effect of waterimmersion restraint stresss on leptin expression in submandibular gland of rats
【Abstract】 AIM: To observe the changes of leptin expression in submandibular gland of rats following waterimmersion restraint stress and to explore the effects and significance of stress response on leptin secretion in submandibular gland. METHODS: Twenty SpragueDawley rats were divided into waterimmersion restraint stress (WRS) group (n=10) and normal control group (n=10). Localization and distribution of leptin in rat submandibular gland were observed by immunohistochemistry, and the concentrations of leptin in serum and submandibular gland were determined by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS：Leptin immunoreactive cells were mainly located in the epithelial cells of the granular convoluted and striated ducts.The immunocomplexes were distributed in the epithelial cytoplasm of the ducts but not in the nuclei. The staining intensity for leptin in the granular convoluted duct was much higher than that in striated duct. The leptin staining in the ducts of submandibular gland in WRS group was denser than that in normal control group. The concentrations of leptin in both serum and submandibular gland were increased markedly compared with that in normal control group (P<0.01). CONCLUSION: Leptin is widely expressed in the epithelial cells of the granular convoluted and striated ducts of the rat submandibular gland. WRS can lead to the enhanced expression of leptin in rat submandibular gland, and these results suggested that leptin in submandibular gland might be involved in the regulation of stress response process.
【Keywords】 stress; waterimmersion restraint; submandibular gland; leptin; rat
【摘要】 目的：观察应激状态下大鼠颌下腺内瘦素表达的变化，探讨应激反应对颌下腺瘦素分泌的影响及其意义. 方法： 采用水浸束缚应激（WRS）方法，将20只SD大鼠随机均分为WRS组(n=10)和对照组(n=10)，用免疫组织化学方法观察大鼠颌下腺内瘦素的定位与分布；用ELISA法检测两组大鼠血清和颌下腺组织中瘦素水平. 结果： 瘦素免疫反应阳性细胞主要定位于颌下腺导管的颗粒曲管和纹状管，腺泡细胞为阴性，其中颗粒曲管上皮细胞呈强阳性反应. WRS组大鼠颌下腺导管上皮细胞瘦素免疫反应细胞的染色强度高于对照组. 与对照组相比，WRS组大鼠血清和颌下腺中瘦素水平均显著升高（P<0.01）. 结论： 瘦素表达于大鼠颌下腺导管上皮细胞；水浸束缚应激可致大鼠血清和颌下腺中瘦素浓度增加，颌下腺内瘦素可能参与应激反应过程的调节.
【关键词】 应激；水浸束缚；颌下腺；瘦素；大鼠
0引言
瘦素（leptin）是一种由肥胖基因编码的多肽产物被首次发现［1］. 瘦素具有广泛的生物学效应，是一种调节体内脂肪贮存量、能量代谢及维持恒定体重的［2］,在脂肪、胃等多种组织与血液中维持一定的平衡，在机体处于应激、创伤等因素刺激下，血液中瘦素水平发生显著变化，参与摄食行为、脂肪代谢和ATP合成等过程. 近年的研究发现，人和哺乳类动物唾液腺内有瘦素及其受体表达［3-5］. 应激刺激条件下颌下腺内瘦素水平有无变化、其是否参与应激反应过程的调节等问题至今未见研究报道. 本研究采用免疫组织化学方法观察瘦素在大鼠颌下腺的定位与分布；并应用ELISA技术检测水浸束缚应激条件下大鼠血清及颌下腺组织中瘦素水平的变化，以期为深入研究颌下腺内瘦素在应激反应中的调节作用提供实验资料.
1材料和方法
1.1材料健康SD大鼠2只，鼠龄为13 wk，体质量200~250 g，随机均分为WRS(waterimmersion restraint)组（n=10）和正常对照组（n=10）. 采用水浸束缚应激模型［4］. 乙醚麻醉下将大鼠四肢固定于特制的木板上，待动物清醒后，置于高约30 cm的方形塑料桶内，桶内加入温度为21±1℃的冷水，使水面至大鼠的胸骨剑突，经10 h后，即可成功诱发WRS模型. 正常对照组不做任何处理. 动物饲养与实验过程均遵守实验动物饲养与使用的规定进行. 将两组大鼠在乌拉坦（1.2 g/kg）腹腔麻醉下，剖开胸腔，暴露心脏，用5 mL注射器心内取血2 mL于4℃静置2 h，离心（7000 r/min）20 min取上清，-20℃保存备用. 然后从颈部取出双侧颌下腺组织，一侧颌下腺于-70℃保存、留待ELISA检测；另一侧颌下腺组织入Bouins液固定24 h后，常规脱水、石蜡包埋、制成厚5 μm切片，分别裱贴于预先用APES (3aminopropyltriethoxysilane, Sigma公司)处理过的载玻片上，于37℃恒温箱烤干备用.
1.2方法
1.2.1免疫组织化学染色兔抗瘦素多克隆抗体购自武汉博士德公司（Boster）；生物素标记的羊抗兔IgG以及ABC试剂盒均购自Sigma公司. 根据免疫组化ABC染色程序，取制备好的石蜡切片入二甲苯脱蜡10 min×2次，无水乙醇漂洗5 min×2次. 新鲜甲醇配制的3 g/L(V/V)双氧水漂洗30 min，以消除内源性过氧化物酶. 0.01 mol/L PBS(pH 7.3)漂洗5 min×3次. 用15 g/L(V/V)正常羊血清封闭30 min；甩去正常羊血清后，滴加第一抗体兔抗瘦素（1∶200），4℃冰箱内孵育过夜；PBS漂洗5 min×3次，滴加生物素标记的羊抗兔IgG(1∶400)，室温2 h；PBS漂洗5 min×3次，滴加ABC复合物1 h(1∶200)；PBS漂洗5 min×3次，DAB H2O2显色8~15 min；常规脱水、透明、DPX封片. 用正常兔血清替代瘦素抗体作为第一抗体进行染色作为阴性对照实验.
1.2.4颌下腺及血清中瘦素的检测瘦素 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司（Boster），具体操作步骤按试剂盒说明书进行. 取冻存的颌下腺组织、称重，用2 mL匀浆器匀浆（加1 mL PBS）. 组织匀浆液用样品稀释液稀释5倍，将预先配置好的标准品和样品各0.1 mL加入酶标板孔内，室温孵育5 h；甩去酶标板内液体、不洗，每孔滴加生物素化抗瘦素抗体工作液0.1 mL， 37℃反应1 h；0.01 mol/L PBS洗涤3 min×3次；ABC工作液每孔0.1 mL（TMB空白显色孔除外），37℃反应1 h，0.01 mol/L PBS洗涤5 min×3次；TMB显色液每孔90 μL，37℃避光反应25 min；TMB终止液每孔0.1 mL终止显色. 酶标仪在450 nm测定A值，绘制标准曲线，各样品浓度. 血清内瘦素测定同法进行.
统计学处理： 实验数据以x±s表示，两组间用t检验进行分析， P<.05认为有统计学意义.
2结果
2.1瘦素在大鼠颌下腺的定位与分布大鼠颌下腺组织的实质由腺泡和导管组成，其中纹状管和颗粒曲管（GCT）是导管的主要部分. 瘦素在正常及WRS大鼠颌下腺组织均有表达，免疫反应产物呈棕褐色颗粒状，定位于导管上皮细胞的胞浆和胞膜、细胞核未见阳性物质沉着，对比明显，背景清晰. WRS组与正常对照组大鼠颌下腺内瘦素免疫反应阳性细胞的分布基本一致，它们均位于颌下腺导管的纹状管和颗粒曲管，其中颗粒曲管上皮细胞呈强阳性反应、纹状管上皮细胞呈中等阳性反应. WRS组大鼠颌下腺导管上皮细胞瘦素免疫反应细胞的染色强度高于对照组（图1A,B），正常兔血清替代一抗的阴性对照切片未见特异性着色.
A：对照组；B：WRS组
图1大鼠颌下腺内瘦素免疫反应阳性细胞的定位与分布×200 （略）
2.2水浸束缚应激对大鼠血清和颌下腺组织中瘦素表达的影响WRS大鼠血清和颌下腺组织中瘦素浓度均显著高于对照组（P<0.01，表1）.
表1水浸束缚应激对大鼠血清和颌下腺组织中瘦素水平的影响（略）
aP<0.01 vs对照.
3讨论
颌下腺是三大唾液腺之一，属外分泌腺，但随着研究的深入，人们发现下颌下腺是具有外分泌和内分泌双重功能的腺体，其内含有多种生物活性物质. 大鼠颌下腺导管由闰管、颗粒曲管、纹状管和小叶间导管组成，其中颗粒曲管粗长而弯曲，颌下腺分泌的生物活性物质主要定位于颗粒曲管细胞内. 迄今已在大鼠颌下腺内发现和分离出30多种生物活性肽. 彭彦霄等［5］首先观察了大鼠颌下腺内瘦素的定位与分布，发现瘦素免疫反应阳性细胞主要分布于导管中的纹状管和颗粒曲管. 本研究进一步证实了上述结果，并发现WRS时颌下腺导管上皮瘦素免疫染色强度增加. 有研究者在健康人唾液涂片中亦发现有瘦素阳性微粒，表明成人下颌下腺具有分泌瘦素的功能，其分泌途径为外分泌方式. 瘦素随唾液进入消化道后，与消化道的瘦素受体结合，可促进胃肠粘膜分泌、增强胃动力、促进小肠吸收、促进粘膜细胞增生和粘膜修复等. 应激是有害或过强刺激引起的机体非特异性反应，应激可致体内多种内分泌激素水平和代谢活动的改变. 传统观点认为，应激效应的机理是由于交感神经兴奋和下丘脑－垂体－肾上腺轴功能活动的增强. 近年来的研究发现，脑－肠肽也参与了应激过程的调控. 有关瘦素在应激反应的作用已有一些研究报道. 手术创伤应激可导致患者血清瘦素浓度持续升高，并且与C反应蛋白和ACTH水平的变化无相关性，因而推测瘦素可能作为一种独立因素影响创伤应激的病理生理过程［6］. Konishi等［7］的研究亦证明，水浸束缚应激大鼠血清瘦素水平显著升高，应激刺激开始后9 h达高峰；而胃内瘦素在应激开始后6 h和9 h时显著下降，脂肪组织中瘦素水平在应激开始后3h显著升高. 这说明WRS后血清瘦素水平变化与胃和脂肪组织内瘦素分泌有关，瘦素水平瘦应激事件的调节. 而本研究结果证明，水浸束缚应激大鼠血清和颌下腺组织中瘦素浓度均显著增高，从而提示应激状刺激可影响颌下腺内瘦素的分泌，多种组织分泌的瘦素进入血循环，进而影响应激反应的进程和结果.
关于应激刺激下颌下腺内瘦素分泌增加的意义，我们推测可能与应激过程中下列因素有关. 首先，瘦素促进脂肪进入高分解状态，使ATP生成增加；其次，瘦素促进细胞损伤的修复和增殖，有利于减少应激组织细胞损伤；第三，瘦素可降低非特异性炎症反应，因而应激时瘦素升高是机体的一种保护机制.
本研究通过对应激状态下大鼠颌下腺组织中瘦素表达的检测，发现瘦素可能在应激引起机体内分泌和代谢紊乱中发挥重要作用. 进一步探讨应激条件下颌下腺内瘦素与其它经典脑肠肽之间的相互作用，将有助于阐明应激导致消化道内分泌功能紊乱的机制.
【】
［1］ Zhang Y, Proenca R, Maffei M, et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue［J］. Nature, 1994, 372(6505):425-432.
［2］ Moller N, O'Brien P, Nair KS. Disruption of the relationship between fat content and leptin levels with aging in humans［J］. J Clin Endocrinol Metab, 1998, 83(3):931-934.
［3］ De Matteis R, Puxeddu R, Riva A, et al. Intralobular ducts of human major salivary glands contain leptin and its receptor［J］. J Anat, 2002,201:363-370.
［4］ Bohlender J, Rauh M, Zenk J, et al. Differential distribution and expression of leptin and the functional leptin receptor in major salivary gland of humans［J］. J Anat, 2002,201:363-370.
［5］ 彭彦霄, 伍雪芳, 王惠珠，等. 瘦素及其受体在大鼠下颌下腺的定位研究［J］. 解剖学报，2004,35(6): 640-642.
［6］ 颜光涛, 郝秀华, 薛辉，等. 血清瘦素在手术创伤后应激反应中的变化［J］. 危重病急救医学. 2006, 18(3): 172-175.
［7］ Konishi N, Otak M, Odashima M, et al. System stress increases serum leptin level［J］. J Gastroenterol Hepatol，2006,21(7):1099-1102.
