小鼠Wnt
【关键词】 Wnt
Expression and biological activity of mouse Wnt3a gene in NIH3T3 cells
【Abstract】 AIM: To express recombinant mouse Wnt3a signal protein with biological activity. METHODS: The recombinant eukaryotic expression plasmid, pSecTag2/Hygro BWnt3a, was transfected into NIH3T3 cells by liposome, then the expressed protein was detected by Western Blot. The saturation density and the capability of suppressing apoptosis in Wnt3a/NIH3T3 cells were evaluated. RESULTS: The Wnt3a signal protein was stably expressed in Wnt3a/NIH3T3 cells. The saturation density and the capability of suppressing apoptosis in Wnt3a/NIH3T3 cells were markedly increased. CONCLOUSION: We successfully construct the recombinant Wnt3a signal protein with biological activity.
【Keywords】 Wnt3a; eukaryotic expression; contact inhibition; apoptosis
【摘要】 目的： 表达具备生物活性的重组小鼠Wnt3a信号蛋白. 方法： 应用脂质体转染试剂将重组真核表达载体pSecTag2/Hygro BWnt3a转染并筛选稳定表达的NIH3T3细胞，Western Blot鉴定重组Wnt3a蛋白的表达，并对Wnt3a/NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力给予检测. 结果： Wnt3a信号蛋白在Wnt3a/NIH3T3细胞中获得稳定表达，Wnt3a信号蛋白能够明显提高NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力. 结论： 在NIH3T3细胞中表达的重组Wnt3a信号蛋白具备生物活性.
【关键词】 Wnt3a；真核表达；接触抑制；细胞凋亡
0引言
小鼠Wnt3a基因是Wnt基因家族中的重要成员，其编码表达Wnt3a信号蛋白. Wnt3a信号蛋白可以激活经典的Wnt/βcatenin信号通路. Wnt3a信号蛋白对神经干细胞表现出明显的促神经元分化的作用. 我们应用基因重组的方法，从小鼠胚脑中克隆Wnt3a cDNA，构建真核表达载体，通过阳离子脂质体试剂将目的基因导入NIH3T3细胞中，建立稳定表达Wnt3a信号蛋白的NIH3T3细胞株，并对其生物学活性进行初步分析.
1材料和方法
1.1材料真核表达载体pSecTag2/Hygro BWnt3a由本研究室构建. NIH3T3细胞株由安徽医科大学病理教研室吴强教授惠赠. 多聚赖氨酸购自博士德公司；胎牛血清及DMEM购自Gibco公司. 潮霉素及LipofectamineTM 2000转染试剂盒、购自Invitrogen公司. 质粒小量提取试剂盒Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification system, Reverse Transcription System RTPCR试剂盒购自Promega公司；鼠抗myc mAb、鼠抗β catenin mAb 购自Santa Cruz公司，FITC标记的兔抗鼠二抗、TRITC标记的兔抗鼠二抗购自北京中山公司；台盼蓝购自sigma公司. 其他试剂均为进口分装或国产分析纯.
1.2方法
1.2.1NIH3T3细胞的培养将冻存的NIH3T3细胞复苏后用含100 g/L的胎牛血清的DMEM 培养液，在37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养，3 d换液1次,传代3至4次使细胞达到良好的生长状态.
1.2.2NIH3T3细胞的转染按LipofectamineTM 2000试剂说明书操作进行. 转染前24 h用胰蛋白酶消化贴壁的NIH3T3细胞，再以无血清及无双抗的DMEM培养基重悬，并按1×105的细胞密度接种于6孔培养板，培养24 h后，当细胞生长至85%～90%融合度时，取纯化的重组质粒pSecTag2/Hygro BWnt3a 2 μg，溶于250 μL无血清的DMEM培养基中，得到A液. 取3 μL LipofectamineTM 2000加于97 μL无血清的 DMEM培养基中，得到B液. 将A, B液混匀，室温放置30 min 后加入0.8 mL含100 g/L胎牛血清的DMEM培养基，轻轻混匀，均匀滴加于经无血清培养基洗涤的贴壁细胞表面，于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h. 弃去转染液，加2 mL完全培养液继续培养. 转染后48 h，待细胞生长至接近融合时收集上清，并按1∶3的密度传代. 继续培养至细胞密度达50%～70%. 弃去培养液，更换浓度为600 mg/ L的潮霉素培养液进行筛选. 转染时，设置转染空载体pSecTag2/Hygro B的组和正常细胞阴性对照组. 约14 d后，可见有阳性克隆形成，继续扩增培养. 稳定表达Wnt3a蛋白的细胞株命名为Wnt3a/NIH3T3（W/3T3），转染空载体的细胞株命名为empty/NIH3T3（E/3T3），正常细胞阴性对照组命名为control/NIH3T3（C/3T3）.
1.2.3重组Wnt3a蛋白鉴定转染48 h后，分别收集C/3T3, E/3T3和W/3T3细胞各约1×106及其培养上清液. 以SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，并将其与细胞培养上清液真空冷冻干燥，浓缩至1/2体积，以鼠抗myc mAb为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，使用Western Blot方法行重组Wnt3a蛋白的鉴定.
1.2.4βcatenin的表达鉴定分别在转染后6, 12, 24 h收集W/3T3, E/3T3及C/3T3细胞各约1×106，以SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，以鼠抗βcatenin mAb为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，使用Western Blot方法进行鉴定.
1.2.5Wnt3a/NIH3T3细胞增殖特性的鉴定以密度约1×105接种W/3T3, E/3T3及C/3T3细胞于24孔培养板，隔日观察，台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞.
1.2.6Wnt3a/NIH3T3细胞抗凋亡实验以密度约1×105接种W/3T3, E/3T3及C/3T3细胞于24孔培养板，24 h后台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞数，同时更换含10 g/L胎牛血清的DMEM培养液，定时观察并台盼蓝染色并使用血细胞计数板计数活细胞，存活细胞与原始细胞数的比值.
统计学处理： 用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析.
2结果
2.1重组Wnt3a蛋白在的NIH3T3细胞中获得表达Western Blot鉴定发现转染Wnt3a基因的NIH3T3 细胞裂解液中有一Mr约为45×103的特异性条带，在转染Wnt3a基因的NIH3T3细胞培养上清液、E/3T3及C/3T3细胞裂解液和细胞培养上清液中，均未发现相应条带(图1).
1: W/3T3组细胞裂解液；2： W/3T3组细胞培养上清液；3： E/3T3组细胞裂解液；4： C/3T3组细胞裂解液.
图1Westem Blot鉴定Wnt3a信号蛋白的表达（略）
2.2Wnt3a/NIH3T3细胞中βcatenin的表达上调对Wnt信号通路中的重要信息分子β catenin的表达情况进行Western Blot鉴定，在Mr约90×103处出现特异性条带(图2)，但无时间依赖性.
1~3: 培养6, 12, 24 h.
图2各实验组βcatenin表达（略）
2.3Wnt3a/NIH3T3细胞融合密度明显增高经台盼蓝染色计数活细胞，以密度约1×105接种的E/3T3及C/3T3细胞3 d后生长至融合密度，此时细胞融合密度约4.6×105，但W/3T3细胞继续生长至第6 d，细胞融合密度约13×105，与另外两组相比，W/3T3细胞融合密度明显增高（P<0.01）(图3，4).
A： W/3T3；B： E/3T3；C：C/3T3.
图3各实验组细胞融合密度观察(倒置×100)（略）
2.4W/3T3细胞抗凋亡能力明显增高经台盼蓝染色计数活细胞，更换含10 g/L胎牛血清的培养液48 h后，E/3T3及C/3T3细胞大量凋亡，细胞数明显减少，但W/3T3细胞数无明显减少，抗凋亡能力明显提高（P<0.01）(图5，6).
图4实验组细胞数变化（略）
A： W/3T3；B： E/3T3；C：C/3T3.
图5各实验组细胞抗凋亡能力观察(倒置×100)（略）
图6实验组存活细胞比例（略）
3讨论
Wnt信号蛋白为含有23～24个保守型半胱氨酸残基,在人类的基因组中已经发现Wnt基因19种［1-2］. Wnt3a是Wnt基因家族的重要成员，其基因早在1992年就已经被发现，而且多种的真核细胞被用于它的表达，但由于其低溶解度及疏水性等特点，一直未能纯化出具备生物活性的Wnt3a信号蛋白. 1998年，Shibamoto等［3］使用L细胞（鼠胸腺激酶缺陷细胞株；LM TK）作为表达细胞时，在培养上清中发现了大量具备生物活性的Wnt3a蛋白，约400 μg/L. Willert等［4］所纯化的Wnt3a信号蛋白通过激活Wnt信号通路促使骨髓中的造血干细胞分裂和自我复制，认为Wnt可能在一系列组织的自我更新中起信号作用.
βcatenin是经典的Wnt/βcatenin信号通路中重要的信息分子［5］，其在Wnt信号通路关闭的情况下，βcatenin被磷酸化而迅速降解. Wnt信号通路被激活后，βcatenin在胞内大量聚集，并进入细胞核，启动下游靶基因的转录，产生生物学效应. βcatenin表达的明显上调代表Wnt信号通路被激活. 实验中Western Blot鉴定发现βcatenin表达明显上调，但没有发现与时间有依赖关系. 实验中表达的重组Wnt3a信号蛋白带有myc标签，Burrus等［6］认为如果Wnt3a信号蛋白带有标签将影响其活性，甚至失活. 但同样有［7,8］中应用的Wnt3a信号蛋白带有myc, HA等标签，而且文献中对其活性同样做了详细的描述. 本实验够构建的重组Wnt3a信号蛋白具备生物学活性，但未能与野生型（wild type）Wnt3a信号蛋白活性做详细的比较，其生物学活性的变化有待进一步分析.
Wnt3a蛋白可以促进神经干细胞向神经元分化. 在使用含有Wnt3a信号蛋白的条件培养液培养E11.5d的胎鼠前脑神经干细胞发现，神经干细胞大量分化成为MAP2阳性的神经元. 去除Wnt3a信号蛋白后，神经干细胞恢复增殖能力，而且当条件培养液中的FGF2去除后，分化的神经元形态更为成熟［8-9］. 来源于小鼠大脑皮质的神经干细胞转基因后超表达Wnt信号蛋白，即使在培养液中加入FGF2，依然大量向神经元分化，但阻断Wnt信号通路后神经元的分化被抑制［10］.
Wnt信号通路的生物学作用十分复杂，不同的Wnt基因，不同的细胞，甚至不同的细胞状态都有可能产生不同的作用［11］. 在本实验中我们采用pSecTag2/Hygro BWnt3a真核表达载体，NIH3T3细胞作为表达细胞，成功表达重组Wnt3a信号蛋白，初步探讨了Wnt3a信号蛋白的生物学活性，为进一步建立用于以为目的的分子移植的方法奠定基础.
【文献】
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