人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定

           作者：潘巍巍，成海恩，赖国旗，易发平，马永平，宋方洲

【关键词】  人类乳头状瘤病毒,人；腺病毒科

　　Construction and identification of recombinant adenoviruses carrying HPV16 E6E7

　　【Abstract】 AIM: To construct the replicationdeficient recombinant adenoviruses carrying human papillomavirus 16（HPV16）E6E7 and identify the vector with Western Blot. METHODS: The HPV16 E6E7 gene fragment was obtained from the plasmid pET32a（+）E6E7 by amplification and digestion, and the shuttle plasmid pAdTrackCMVE6E7 in which the E6E7 was inserted into the downstream of CMV promoter was  established by ligation.Then the linearized shuttle plasmid was cotransformed into BJ5183 bacteria with backbone  vector AdEasy1 to obtain the recombinant adenoviral plasmid pAd E6E7 by homologous recombination. The recombined adenovirus DNA was transfected into 293 cells for packing and the amplification product of replicationdeficient AdE6E7 virus was purified by CsCl density gradient centrifugation. The expression of E6E7 was verified  by Western Blot in 293 cell after infected with AdE6E7. RESULTS: The recombinant plasmid pAdE6E7 was established by homologous recombination and confirmed by restriction endonuclease digestion and sequencing. GFP expression could be observed 3 d  after packing of the linearized pAdE6E7 in 293 cells and  6.9×1010  pfu/L titer of Ad E6E7 was obtained by CsCl gradient purification.  The 293 cell was infected  with this  titer of Ad E6E7 viruses, and then  total protein in 293 cells was extracted.  Western Blot showed that  E6E7 protein was expressed obviously. CONCLUSION: Ad E6E7  expressing both GFP and E6E7 simultaneously can be simply and rapidly generated by using the AdEasy system.
 
　　【Keywords】     papillomavirus, human; adenoviridae

　　【摘要】 目的：  利用AdEasy系统构建人乳头瘤16(HPV16)E6 E7基因重组腺病毒，并通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达. 方法：  将质粒pET32a（+）E6E7扩增、酶切获得E6E7片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrackCMV的巨细胞病毒（CMV）启动子下游，构建重组穿梭载体pAdTrackCMVE6E7，线性化后与骨架载体AdEasy1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAdE6E7，经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdE6E7；用包装后的病毒上清再次感染293细胞，提取细胞中的蛋白，通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达. 结果：  连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAdE6E7；经人胚肾293细胞包装，3 d后观察到绿色荧光蛋白（GFP）明显表达，氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010 pfu/L滴度的重组病毒；用该滴度的AdE6E7重新感染人胚肾293细胞3 d后，提取细胞蛋白,Western Blot检测,E6E7有明显表达. 结论：  利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6E7的重组腺病毒Ad E6E7.
 
　　【关键词】 人类乳头状瘤病毒，人；腺病毒科

　　0引言

　　高危型人类乳头瘤状病毒（HPV16, 18）与宫颈癌的发病密切相关［1］. HPV编码了多种癌蛋白（E1, E5, E6, E7等）其中以E6, E7为主，他们都能诱导细胞永生化，引起细胞的永生. 复制缺陷型重组腺病毒(replicationdeficient recombinant adenovirus)是目前基因最常用的载体之一［2］，我们利用AdEasy系统构建了外源插入HPV16 E6E7片段的复制缺陷性腺病毒Ad E6E7，并观察了Ad E6E7感染293细胞，为研究HPV16 E6E7在女性宫颈癌中的作用提供新的手段.

　　1材料和方法

　　1.1材料穿梭质粒pAdTrackCMV，骨架质粒pAdEasy1，仅插入GFP的对照重组腺病毒质粒pAdGFP，大肠杆菌BJ5183由重庆医科大学肝病研究所惠赠；293细胞、E. coli, DH5a由本实验室保存. pET32a（+）E6E7载体已构建成功. PmeⅠ, PacⅠ限制性内切酶购自基因公司；BglⅡ, HindⅢ限制性内切酶、连接试剂盒、DNA小量胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；LipofectaminTM2000脂质体转染试剂盒购自Roche公司，DMEM培养基及胎牛血清购自Hyclon公司；蛋白Marker购自Tian gene公司；驴抗鼠的E6单克隆抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的E6二抗及DAB显色系统购自北京中山公司.
 
　　1.2方法BglⅡ和HindⅢ分别双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV 和pET32a（+）E6E7，凝胶回收E6E7片段和线性化的pAdTrackCMV，连接（16℃, 8 h），转化DH5a感受态细菌，在卡那酶素抗性的LB平板上培养过夜，挑选转化的菌落，提取质粒，BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定阳性克隆，同时送上海生物工程公司测序分析. 提取pAdtrackCMVE6E7质粒，取1 μg用PmeⅠ线性化，胶回收线性化的pAdtrackCMVE6E7质粒，转化到含有腺病毒基因组质粒AdEasy的BJ5183感受态细胞中［3］，在卡那酶素抗性的LB平板上培养16～24 h，挑选较小的菌落培养，抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用PacⅠ酶切鉴定. PacⅠ线性化Ad E6E7，乙醇、醋酸钠沉淀，700 mL/L乙醇漂洗后重新溶解在20 μL灭菌的去离子水中. 配制A液（质粒DNA4 μg+无血清DMEM至250 μL）和B液（10 μL LipofectaminTM2000以无血清DMEM稀释至250 μL），A，B混合，37℃反应2 h. PBS漂洗细胞后每孔加入2 mL无血清培养液，将混合物轻倾于培养孔中轻轻混合，继续培养8 h后更新完全培养基，直至90%以上293细胞出现病变（cytopathic effect, CPE）. 收集上清继续感染293细胞以扩增病毒. 用氯化铯密度梯度离心法纯化重组重组腺病毒Ad E6E7. 收集后的病毒层，0.22 μm无菌过滤后小份分装，-80℃保存. Trizol试剂提取重组腺病毒感染293细胞和未感染293细胞的RNA取1μg细胞总RNA进行逆转录反应，总反应体积为50 μL, 37℃反应1 h, 95℃ 5 min，灭活逆转录酶. PCR扩增E6E7片段的上游引物PF: 5＇cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物PR: 5＇cgggatcccatggtagattatggtt3＇. 反应条件：95℃变性5 min, 95℃  30 s, 58℃ 30 s, 72℃  1 min，30个循环，72°C延伸10 min. RIPA提取Ad E6E7感染293细胞和未感染293细胞的总蛋白，变性后做SDSPAGE电泳，转膜，条件为6V恒压，3.5 h. 驴抗羊的E6单抗、HRP标记的二抗，杂交反应后DAB显色. 根据［3］用已获得的重组腺病毒感染HEK293细胞，得到扩增的病毒粗提液，将病毒粗提液进行对数稀释，通过终点稀释试验病毒滴度. 终点稀释实验中滴度计算公式： 病毒滴度（pfu/L）=104（x+0.8），x为各行阳性率总和.

　　2结果

　　2.1腺病毒穿梭载体pAdtrackCMVE6E7的构建和鉴定用BglⅡ和HindⅢ分别双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV, pET32a（+）E6E7和pAdtrackCMVE6E7质粒（图1），可以获得860 bp的E6E7基因和8.9 kb的pAdTrackCMV.

　　1: Marker: λHindⅢ; 2: pAdTrackCMV/BglⅡ, HindⅢ;    3: pET32E6E7/BglⅡ, HindⅢ; 4:  pAdTrackCMVE6E7/BglⅡ, HindⅢ;       5:  Marker: 2000.

　　图1腺病毒穿梭载体pAdtrackCMVE6E7鉴定（略）

　　2.2E6E7重组腺病毒基因组质粒的构建和鉴定同时将pAdtrackCMVE6E7质粒和pAdtrackCMV空质粒用PmeⅠ线性化后，转化到含有AdEasy1的BJ5183感受态细菌中，与其内的AdEasy1进行同源重组. PacⅠ酶切后，可见4.5 kb和23 kb处各有1个条带（图2）.

　　1.3AdEasyE6E7重组腺病毒感染293细胞的鉴定脂质体包裹AdEasyE6E7同源重组腺病毒基因组质粒转染293包装细胞1~2 d后，光镜下可观察到空斑形成，细胞变圆、肿胀、脱壁、细胞核变大等病变.    荧光显微镜下观察，重组腺病毒感染的293细胞和pAdtrackCMV感染的293细胞，在培养1～2 d后有EGFP表达，并逐渐增多. AdEasyE6E7重组腺病毒感染的293细胞，RTPCR检测显示有1条860 bp条带，而pAdtrackCMV空载体感染的293细胞的相应位置无特异条带（图3）.  AdEasyE6E7重组腺病毒感染的293细胞，用Western Blot检测显示有1条能与E6单抗特异性结合的蛋白印迹条带，而pAdtrackCMV空载体重组后的腺病毒AdEasyCMV感染的293细胞的相应位置无特异条带（图4）. 经终点稀释实验测定得到重组复制缺陷型病毒滴度为6.9×1010 pfu/L.

　　1:  Marker: λHindⅢ;  2:  pAdTrackk14E6E7/BamHⅠ; 3: 重组后的pAd TrackCMV E6E7/PacⅠ; 4: 重组后的pAd TrackCMV.

　　图2PacⅠ酶切鉴定AdEasyE6E7 （略）

　　1: Marker: 100 bp DNA Marker; 2: RTPCR 产物: E6E7基因 （860bp）; 3: RTPCR阴性对照.

　　图3RTPCR鉴定AdEasyE6E7 转染的293细胞中E6E7的表达（略）

　　1:  E6E7; 2: NO  E6E7.

　　图4Western  Blot鉴定AdEasyE6E7/AdEasyCMV（略）

　　3讨论

　　目前基因中应用最广泛的生物病毒载体有反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体，其中腺病毒的优于其他载体的特点［4-5］. 腺病毒载体可转导非分裂细胞，并在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量，最后腺病毒载体进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高. 已被美国FDA批准作为基因治疗载体应用于临床实验.
 
　　我们先将AdEasy1骨架载体转化到用CaCl2制备的BJ5183感受态中，然后再将线性化的pAdtrackCMVE6E7转化进含有AdEasy1的BJ5183制成感受态，同源重组［6-7］. 已转化了AdEasy1质粒的BJ5183细胞更方便进行细菌内同源重组，免去了在真核细胞内重组筛选复杂、费时的缺点. 为了验证重组腺病毒是否带有目的基因E6E7，进行了如下鉴定： 对pAdtrackCMVE6E7质粒酶切和测序，结果证明目的基因E6E7正确插入到穿梭载体； pAdtrackCMVE6E7经PacⅠ酶切后，可见4.5 kb和23 kb两条带，说明重组成功；构建腺病毒载体的穿梭质粒pAdtrackCMV中的构建元件已插入EGFP表达盒，重组腺病毒转染293细胞后，通过荧光显微镜观察，可见293细胞有绿色荧光蛋白表达，并逐渐出现生长停止和空斑形成，证明AdEasyE6E7已包装入293细胞； 通过RTPCR和Western  blot方法证明了AdEasyE6E7转染293细胞后有E6E7核酸和蛋白的表达. 这个载体的构建对于进一步研究HPV16 E6E7体内、体外基因治疗实验奠定了基础.

　　【】

　　［1］ Anderssom S, Rylander  E, Larsson B, et al. The role of human papillomavirus in cervical adenocarcinoma carcinogenesis ［J］. Eur J Cancer, 2001,37(2):246-250.

　　［2］ Cheng K, Fraga D, Zhang C, et al. Adenovirusbased vascular endothelial growth  factor gene delivery to human pancreatic islets ［J］. Gene Ther, 2004,11（14）:1105-1116.

　　［3］ 滑玮，辛晓燕，苏明权，等. 修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定［J］. 第四军医大学学报，2003,24（8）:734-737.

　　［4］     Siemens DR, Crist S, Austin JC, et al. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue   specificity in a bladder cancer model. ［J］ J Urol  2003,170:979-984.
 
　　［5］  Davis AR, Wivel NA, Palladino JL, et al. Construction of adenoviral vectors［J］.  Mol Biotechnol, 2001,18:63-70.

　　［6］ 郑权，黄宗海，汤福祥等. 应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒［J］. 第一军医大学学报，2003,23（6）:575-577.

　　［7］     Green AP, Huang JJ, Scott MO, et  al. A new scalable method for the purification   of recombinant adenovirus vectors ［J］. Hum Gene Ther,   2002,13:1921-1934.