尿激酶对大鼠胸膜成纤维细胞增殖与细胞凋亡的影响

        作者： 邵景韫，刘安，戚好文，董玉

【关键词】  尿激酶；胸膜;成纤维细胞；细胞凋亡

     　Effect of urokinase on cell proliferation and apoptosis of rat pleural fibroblasts

    【Abstract】 AIM： To study the effect of urokinase on the cell proliferation and  apoptosis of rat pleural fibroblasts. METHODS: Rat pleural fibroblasts were primarily cultured to 4-12 passages， and then the medium was added with urokinase of different concentrations. After another 24-96 h culture， light microscope was used to observe morphological change. Apoptosis bodies were examined by fluorescent staining. Flow cytometry was used to detect apoptotic cells. RESULTS: Urokinase decreased the number of viable cells in time and concentration dependent manners. No apoptosis body or apoptotic cells were found by flow cytometry. CONCLUSION: Antiproliferative effect of urokinase on rat pleural fibroblasts is confirmed， but not related to cell apoptosis.

    【Keywords】 urokinase；pleura; fibroblasts；apoptosis

    【摘要】 目的：研究尿激酶（UK）对大鼠胸膜成纤维细胞（FB）增殖与细胞凋亡的影响. 方法：将大鼠胸膜FB原代培养，4～12代用于实验，FB与不同浓度UK共培养24～96 h；用光学显微镜观察其形态学改变；荧光染色查找凋亡小体；流式细胞技术观察有无凋亡细胞出现. 结果：UK以时间和浓度依赖的方式抑制细胞生长，但未发现凋亡小体，流式细胞技术没有检测到凋亡细胞. 结论：UK能够抑制FB增殖，其机制与细胞凋亡无关.

    【关键词】 尿激酶；胸膜;成纤维细胞；细胞凋亡

      胸膜纤维化是难治性胸膜炎的病理基础，胸膜成纤维细胞（fibroblasts, FB）增殖又是胸膜纤维化的主要原因. 目前，临床上应用尿激酶（urokinase, UK）防治炎性胸膜炎形成胸液包裹、胸膜黏连、肥厚等获得了明显效果，但机制不甚明确［1-3］. 因此，我们以研究大鼠胸膜FB为靶位，观察UK对大鼠胸膜成纤维细胞增殖的抑制作用，探讨作用机制， 为UK防治炎性胸膜炎提供理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料健康雄性SD大鼠1只,体质量160 g(第四军医大学实验动物中心)；胎牛血清(FBS,杭州四季青公司)；RPMI 1640培养液、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；UK(辽宁天龙药业有限公司)；丫啶橙，MTT（华美生物工程公司）；小鼠抗大鼠波形蛋白mAb, 小鼠抗大鼠角形蛋白mAb, 小鼠抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原mAb, 小鼠抗大鼠CD45抗原mAb(武汉博士德生物工程有限公司)；CO2恒温培养箱(德国Heraeus公司)；倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；酶连免疫检测仪(国营华东管厂)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司).

    1.2方法

    1.2.1胸膜FB的分离、培养、纯化与鉴定用脊椎脱臼法处死SD雄性大鼠，无菌剥离胸膜，剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的碎块，均匀铺满培养瓶底，加入含100 mL/L FBS的RPMI 1640培养液，于37℃,50 mL/L CO2条件下培养，2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶2传代培养，纯化. 倒置显微镜下观察细胞学形态，对第4代细胞进行细胞鉴定，以卵蛋白生物素过氧化物酶复合法(ABC)法分别用抗细胞波形蛋白、抗细胞角形蛋白、抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原的小鼠抗大鼠mAb作免疫细胞化学染色鉴定胸膜FB.

    1.2.2MTT法观察UK对大鼠胸膜FB增生的作用以2.5 g/L胰蛋白酶消化第4～6代大鼠胸膜FB,将单细胞悬液以5×107/L密度接种于96孔培养板,每孔200 μL，37℃，50 mL/L CO2条件下培养，2～3 d后细胞长满96孔培养板的1/2，再用无血清的RPMI 1640培养24 h，使细胞同步于G0期. 然后更换培养液，加入含有不同浓度UK的培养基（0，5×106，10×106，20×106，30×106 U/L），设12个复孔，分别培养24，48，72，96 h. 实验结束前4 h，每孔加入MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡15 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔A490 nm值. 以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线.

    1.2.3观察UK对大鼠胸膜FB凋亡的作用

    1.2.3.1光镜形态学观察在6孔培养板中加入盖玻片，细胞长满后加入不同浓度的UK（5×106，10×106，20×106，30×106 U/L），不加药孔为对照组，24 h后收集盖玻片，PBS冲洗，纯丙酮固定8 min，用1 g/L的苏木精,0.1 g/L的伊红常规染色、脱水、透明、封片. 光镜下观察形态学改变.

    1.2.3.2细胞荧光染色分别收集经不同浓度UK处理24 h的细胞，加入100 mg/L丫啶橙荧光染色液染色10 min，CaCl2分化，荧光显微镜下进行细胞凋亡的形态学观察.

    1.2.3.3流式细胞仪结合PI及Annexin VFITC双标记染色测定细胞凋亡选对数生长晚期的细胞，分别加入5×103，10×103，20×103，30×103 U/mL UK，24 h后将5×105个细胞转移至离心管，用50 μL结合缓冲液重悬细胞，每组分别加入PI及Annexin VFITC，室温避光30 min上样，立即用流式细胞仪分析凋亡率.

    统计学处理：数据以x±s表示，经SPSS软件分析，组间比较采用Oneway ANOVA检验.

    2结果

    2.1胸膜FB鉴定结果FB经8～10 ｄ培养后铺满瓶底，在倒置显微镜下见细胞呈梭形，胞核卵圆形，位于细胞中央，呈放射状或栅栏状排列（图1）. 成纤维细胞经免疫细胞化学染色后抗细胞波形蛋白抗原阳性（图2），抗细胞角蛋白阴性，抗第Ⅷ因子相关抗原阴性，抗CD45抗原阴性，证实培养细胞为大鼠胸膜FB.

    2.2UK对大鼠胸膜FB增生的抑制作用UK作用后，所有加药组A490 nm值均低于对照组. 其中，5×106，10×106，20×106，30×106 U/L UK较对照组降低显著（P<0.05），显示UK以时间和剂量依赖方式抑制细胞增殖（图3）.

    2.3UK对大鼠胸膜FB凋亡作用的影响光镜形态学观察对照组大鼠胸膜FB大多数呈梭形，胞核卵圆形，位于细胞中央，呈放射状或栅栏状排列. UK作用24 h后，未发现凋亡细胞（图4）. 荧光显微镜形态学观察对照组大鼠胸膜FB大多数呈梭形，胞核卵圆形，位于细胞中央，呈放射状或栅栏状排列. UK作用大鼠胸膜FB 24 h后，细胞核完整，未见凋亡形态细胞（图5）. 凋亡细胞的流式细胞技术检测示UK作用大鼠胸膜FB 24 h后,无明显凋亡细胞出现（图6）.

    3讨论

    细胞凋亡在胸膜炎发生中的作用正逐渐引起了人们的关注. 由于尿激酶能非特异性将纤溶酶原激活成纤溶酶，纤溶酶可降解胸膜腔内的纤维蛋白，从而达到降低胸膜腔积液黏稠性，清除胸膜的粘连和间隔形成，保证胸膜腔积液引流通畅，增加胸膜腔引流，使肺得以重新复张［4］，临床广泛使用尿激酶注入胸膜腔防治胸膜粘连. 但其作用机制复杂，尿激酶是通过抑制大鼠胸膜FB分泌炎性介质，还是诱导细胞凋亡的发生，仍不甚清楚. 因此，研究UK对FB的生长抑制作用和凋亡作用，为UK炎性胸膜炎提供新的理论依据.

　　胸膜为中胚层的浆膜，含有单层间皮细胞，被覆在胸内壁和肺表面的结缔组织上. 胸膜成纤维细胞是胸膜的结构及效应细胞，已证实胸膜内ECM合成的主要细胞是成纤维细胞，它的活化、增殖以及通过释放介质使ECM产生增多在胸膜纤维化发病机制中起决定性作用，而胸膜成纤维细胞的活化、增殖机制是受体内复杂的细胞及细胞因子调节的. 成纤维细胞可分泌多种生长因子和胶原纤维、弹性纤维和网状纤维，影响胸膜的修复和组织再生. 不仅如此，FB还是重要的免疫效应细胞，它可以通过产生多种细胞因子和炎性介质增强和维持组织炎症反应，从而有可能参与胸膜的慢性炎症.

    我们通过MTT法观察UK对大鼠胸膜FB作用24～96 h发现，所有加药组A490 nm值均低于对照组，显示UK以时间和剂量依赖方式抑制细胞增殖. 在光镜下UK并没有诱导大鼠胸膜FB出现核浓缩、核碎裂和染色质边集等凋亡细胞特有的形态学特征；其次荧光镜下未见到核碎裂的凋亡细胞特有的形态学特征；流式细胞技术也没有观察到凋亡细胞的出现，再次证明UK抑制大鼠胸膜FB增殖与细胞凋亡无关. 我们通过MTT法观察到UK以时间和剂量依赖方式抑制大鼠胸膜FB增殖，但没有加速细胞凋亡，其抑制细胞增殖的可能机制分析如下：TGFβ1是由激活的巨噬细胞,淋巴细胞,FB等分泌的一种致纤维化细胞因子，可促进FB的增殖，且随剂量的增加，促增殖效应进一步增强［5］. 在体内，肺组织发生纤维化时， TGFβ1及其mRNA增加最显著［6］. bFGF是一种前纤维化因子，可促进胶原基因启动，从而形成纤维化病变. FB,内皮细胞,平滑肌细胞,肥大细胞等都能合成bFGF， 它又能刺激这些细胞的增殖［7］. 外源性UK可导致胸膜FB和间皮细胞TGFβ1，bFGF表达减少［8-9］，提示此类药物可能通过刺激促纤维化细胞因子表达减少而抑制FB的增殖.

    实验表明，尿激酶可抑制大鼠胸膜成纤维细胞增生，但不能诱导其发生凋亡样改变， 提示尿激酶可以干预胸膜重建中的结构改变及大鼠胸膜成纤维细胞的增生、肥大，但尿激酶抑制大鼠胸膜成纤维细胞增生，不是通过诱导FB凋亡产生的，可能通过减少FB分泌炎性介质，间接参与胸膜重建，这为尿激酶治疗胸膜纤维化提供了新的理论依据.

    【】

    ［1］ 刘淑红，崔朝勃，苏新爱，等.腔内注射尿激酶预防渗出性胸膜炎纤维分隔［Ｊ］.临床肺科杂志，2003，8(1):81.

    ［2］ 丁东，邓群益，张怀岭，等.膜腔内注入尿激酶预防结核性渗出性胸膜炎所致胸膜肥厚和包裹性积液的研究［Ｊ］.中华结核和呼吸杂志，2001，24（1）：32-34.

    ［3］ 闵锐. 纤溶酶原激活物抑制剂1与胸膜纤维化［Ｊ］. 国外医学・呼吸系统分册，2000，20(1):40-41.

    ［4］ 闵锐,杨玉,李淑云,等.胸膜腔内注入链激酶或尿激酶治疗胸膜腔积液［Ｊ］.国外医学・呼吸系统分册,1999,19(1):39.

    ［5］ NegreAminou P，van Vliet AK，van Erck M，et al.Inhibition of proliferation of human smooth muscle cells by various HMGCoA reductase inhibitors；comparison with other human cell types［Ｊ］. Biochem Biophys Acta,1997,1345（3）：259-268.

    ［6］ 马跃文.转化生长因子β与肺纤维化的关系［Ｊ］. 国外医学・呼吸系统分册, 1997，17（1）:27-30.

    ［7］ 宾亮华.生长因子与肺纤维化［Ｊ］.国外医学・生理、病理与临床分册，1997，17(1)：19-21.

    ［8］ 邵景韫，戚好文，刘安. 胸腔积液中TGFβ1、VEGF、bFGF、PAI1的检测及其临床意义 ［Ｊ］. 陕西医学,2006，35(1)：100-101.

    ［9］ 邵景韫，戚好文，刘安. 尿激酶对胸膜成纤维细胞分泌转化生长因子β1的影响［Ｊ］.西安大学学报（医学版）, 2005， 26(6)：569-571.