苦参素防治阿霉素肾病鼠肾小球硬化

【关键词】  苦参素；多柔比星/副作用；肾病综合症/化学诱导；大鼠；Smads蛋白；转化生长因子β1

      　Experimental study of oxymatrine in preventing glomerulosclerosis in rats with adriamycininduced nephropathy

    【Abstract】 AIM: To observe the longterm renoprotective effects of oxymatrine on the adriamycininduced nephropathy rats with chronic progressive renal lesions, and explore its mechanisms. METHODS: The experiments were performed on 60 male Wistar rats. The rats were randomly divided into 4 groups: normal control group, oxymatrine 50 mg/(kg・d)  treatment group, oxymatrine 100 mg/(kg・d) treatment group, model group. Adriamycin (2 mg/kg) was intravenously administered twice at a 21day interval. Oxymatrine was used for gastric perfusion from the 1st day after the second injection of adriamycin until the end of the study. After 7 weeks, 5 rats in each group were sacrificed every 8 weeks for blood biochemical analyses and histological study. Urinary protein (mg/24 h), the concentrations of serum creatinine (Cr) and blood urea nitrogen (BUN) were checked with automatic biochemistry analyzer, and a semiquantitative score was used to evaluate the degree of glomerular lesions. Finally, immunohistochemistry was to examine the expression of transforming growth factorβ1 (TGFβ1), Smad1, 2, 3, 5 and Smad7 in glomeruli. RESULTS: Oxymatrine not only reduced urinary protein, Cr and BUN in blood, but also significantly ameliorated glomerular sclerosis and mesangial proliferation. Meanwhile, immunohistochemistry staining indicated that TGFβ1, Smad1, 2, 3, 5 expressions increased and Smad7 expression decreased in model group as compared with the 2 treatment groups. CONCLUSION: Oxymatrine has a renoprotective effect on the adriamycininduced nephropathy rats with chronic progressive renal lesions, and its mechanism is considered to be relevant to intervention of the pathway of signal conduction of TGFβ1/ Smads.

    【Keywords】 oxymatrine; doxorubicin/adverse effect; nephrotic syndrome/CI; rat; Smads protein; transforming growth factorβ1

    【摘要】 目的：观察苦参素（OM）对阿霉素肾病鼠慢性肾脏损害的长期保护作用，并探讨其可能的作用机制. 方法：60只Wistar大鼠随机分为4组：正常对照组,OM 50 mg/(kg・d)组,OM 100 mg/(kg・d)治疗组,模型组. 采用阿霉素分次尾静脉注射构建肾病慢性进展模型. 各干预组予以相应的剂量进行灌胃，每隔8 wk杀检一批大鼠观察尿蛋白、血清尿素氮、肌酐及肾脏病理指标的改变，并用免疫组化法检测肾组织转化生长因子β1(TGFβ1)，Smad1, 2, 3, 5，Smad7蛋白的表达. 结果：各干预组比模型组尿蛋白排泄量明显减少，血肌酐和尿素氮水平下降，肾小球系膜增生、硬化程度明显减轻；肾小球内TGFβ1和Smad1, 2, 3, 5沉积较模型组明显减少，Smad7的沉积较模型组明显增多. 结论: OM对阿霉素肾病鼠的慢性肾脏损害有一定的保护作用，OM抗肾纤维化的作用可能与干预TGFβ1/Smads信号传导通路有关.

    【关键词】 苦参素；多柔比星/副作用；肾病综合症/化学诱导；大鼠；Smads蛋白；转化生长因子β1

    肾小球硬化是多种原因引起肾小球损伤后的共同转归，主要表现为肾小球细胞外基质（ECM）的过度堆积，最终导致肾小球毁损和功能废弃. 大量研究表明，转化生长因子β（TGFβ）是导致这一变化的最终的关键性因子，它可以促进肾小球固有细胞合成细胞外基质，改变基质降解酶及其抑制因子的量及活性［1］. 苦参素（oxymatrine，OM）是从中药苦豆子中提取的有效成分，有多方面的药理作用和功效，如抗炎、抗过敏、免疫及生物反应调节等作用［2］. 近年来研究发现，OM具有抗肝脏纤维化、抗皮肤纤维化的作用［3-4］，但在抗肾小球硬化方面研究尚少. 本研究采用小剂量大鼠尾静脉注射阿霉素的方法构建肾病慢性进展模型，予OM进行干预治疗，探讨OM对肾病慢性进展模型的作用并进一步探讨其机制.

    1材料和方法

    1.1材料Wistar雄性大鼠60只（由兰州大学基础医学院动物房提供），2月龄，体质量180~200 g. 苦参素，宁夏紫荆花药业有限公司，批号40040909；盐酸阿霉素10 mg/瓶，浙江海正药业股份有限公司，批号040801；兔抗大鼠TGFβ1, Smad1, 2, 3, 5, Smad7 mAb, SABC试剂盒,DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物制品公司.

    1.2方法

    1.2.1模型的制备与分组60只雄性Wistar大鼠适应性喂养2 wk后随机分为正常对照组（A组，15只），OM 50 mg/(kg・d)治疗组（B组，15只），OM 100 mg/(kg・d)治疗组（C组，15只），模型组（D组，15只）. 除正常对照组外其余各组大鼠分别于实验第1日、第21日尾静脉注射阿霉素2 mg/(kg・d)，正常对照组予等量生理盐水尾静脉注射. 于第二次注射药物后（即实验第22日），各干预组（B组,C组）给与相应剂量的OM进行灌胃，正常对照组予等量的生理盐水灌胃直至实验结束，实验共进行27 wk. 每隔8 wk处死一批大鼠进行指标检测.

    1.2.2指标检测①24 h尿蛋白测定： 用代谢笼收集大鼠实验之第0，3，7，11，15，19，24和27 wk时24 h尿液，用三氯乙酸法测定尿蛋白含量. ②血生化检测: 每批处死动物之前股静脉取血用全自动生化分析仪（BeckmanCoulter LX20）测定血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）. ③肾脏病理改变: 大鼠处死后立即用质量分数为40 g/L甲醛固定肾组织，常规石蜡包埋、切片，HE方法染色后观察肾脏的病理改变，参照Raij等［5］的方法评估肾小球硬化程度，每张切片至少观察40个肾小球，根据肾小球硬化灶所占肾小球比例分为5个等级：0级：基本正常；(+)：肾小球硬化面积1%～25%；()：硬化面积26%～50%；()：硬化面积51%～75%；()：硬化面积达到76%～100%. 用公式出肾小球硬化指数（glomerulosclerosis index, GSI）表示肾小球硬化程度，每张切片肾小球平均硬化指数计算公式为：［(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/每张切片肾小球总数］×100%，式中N1代表1级损害肾小球个数,…N4为4级损害肾小球个数. ④免疫组织化学检查： 采用SABC法检测肾组织中的TGFβ1，Smad1, 2, 3, 5，Smad7的沉积. 肾组织切片经常规脱蜡，水化，枸橼酸盐缓冲液修复5 min，质量分数为30 mL/L的H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min， 加入BSA封闭液阻断后，在室温下加入一抗，再用HRP标记的抗兔IgG处理，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 其中TGFβ1 mAb为工作液，Smad1, 2, 3, 5 mAb浓度为1∶50，Smad7 mAb浓度为1∶100. 结果采用计算机图像分析系统（CMIAS）进行半定量分析，每张切片按顺序选10个视野，按阳性染色面积所占视野百分比进行半定量评分后取均值.

    统计学处理： 统计学处理采用SPSS 10.0统计软件，各组数据用x±s表示. 多组间的数据比较采用重复测量方差分析，组间比较采取最小显著差异t检验（LSDt检验）. α=0.05(two tailed)作为检验标准，P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1尿蛋白变化7 wk末模型组和各干预组大鼠尿蛋白开始升高，B组,C组,D组24 h尿蛋白量(mg/24 h)分别为39.0±6.4，31.2±5.5，62.8±10.4，正常对照组为0.9±0.4，随着时间的推移，肾病组大鼠尿蛋白量逐渐增加，19 wk末达到高峰，而干预组大鼠尿蛋白量趋于平稳，整个实验期间模型组尿蛋白量始终大于治疗组(P<0.01，图1).

    2.2各组大鼠血清BUN与Cr的变化模型组大鼠在19 wk末血清BUN与Cr浓度明显升高，与A组相比差异有统计学意义（P=0.000）. 各干预组大鼠直到27 wk末血清BUN和Cr浓度才有显著性升高，与模型组相比，差异有统计学意义（P=0.000，表1）.

    2.3肾脏病理改变光镜下模型组11 wk末可见肾小球代偿性肥大，系膜细胞和基质增多（图2）；19 wk末可见局灶节段性肾小球硬化（图3）；27 wk末大部分肾小球有硬化灶，部分肾小球发生玻璃样变性（图4）. 与模型组相比，各干预组肾脏病理改变较轻，各期肾小球硬化指数较模型组相比明显减低（P=0.000）. 各组肾小球GSI见表2.

    2.4TGFβ1，Smad1, 2, 3, 5和Smad7的免疫组化检测免疫组化染色显示正常对照组TGFβ1在肾小球及肾小管内几乎无阳性表达；Smad1, 2, 3, 5蛋白表达局限于肾小管，肾小球偶见；Smad7蛋白主要在肾小球和皮质肾小管上皮细胞内表达，在髓质的肾小管表达非常少. 各组TGFβ1，Smad1, 2, 3, 5，Smad7半定量检测结果见表3.表1各组大鼠血清BUN，Cr指标比较表2各组大鼠肾小球硬化指数

    3讨论

    各种原因引起的慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰竭，其实质是肾脏纤维化和硬化. 大量研究表明，TGFβ是介导肾小球硬化的共同通路，是ECM沉积、肾纤维化进展的重要调节因子，在调节细胞外基质代谢、参与炎症反应、间质纤维化等方面起重要作用［6］，然而其确切的作用机制至今尚未阐明. Smads家族的发现为促进TGFβ信号通路的认识和作用机制的阐明提供了重要的理论依据. 目前国内外对于TGFβ/Smads信号转导通路在肾小球硬化发生中作用的研究还甚少报道.

    Smads蛋白在调节TGFβ细胞内信号传导中起重要作用. Smads介导TGFβ超家族受体到核基因的信号传递，与其分子结构特点密切相关［7］. 根据其结构和功能的不同分为三类：受体调节性Smads (receptor regulated smads, RSmads)，主要包括Smad1，2，3，5，8，9；通用Smads (common Smads, CoSmads)，主要包括Smads4；抑制性Smads (inhibitory Smads, ISmads)，主要包括Smad6，7［8］. TGFβ与其受体结合后，其Ⅰ型受体磷酸化并激活RSmads，后者与CoSmads形成复合物进入核内调节靶基因的转录. TGFβ可诱导内源性Smad7的表达，而Smad7通过与TGFβ1Ⅰ型受体稳定结合阻止了RSmads的磷酸化激活，从而负反馈调节TGFβ信号传导系统［9］.

    近年来OM由于具有多方面的药理活性而引起了人们广泛的重视和兴趣，目前临床已应用于病毒性表3各组大鼠肾脏TGFβ1，Smad1, 2, 3, 5，Smad7表达 肝炎、变态反应性疾病、细菌感染等多种疾病，并取得了一定的效果. 最近发现OM在抗肝纤维化和皮肤纤维化中有一定疗效，主要作用为抑制多种纤维细胞的增殖和胶原成分合成等［10-11］. 我们曾采用单侧肾切除加1 wk后尾静脉注射阿霉素的方法制备大鼠肾小球硬化模型［12］及采用单侧输尿管结扎术制备肾间质纤维化模型［13］，观察苦参碱对模型鼠的作用. 初步研究显示苦参碱可能通过抑制TGFβ等细胞因子的表达，从而抑制肾小球固有细胞活化、增殖及ECM的分泌，起到抗肾小球硬化和肾间质纤维化的作用.

    本研究是在前期工作的基础上采用分二次尾静脉注射阿霉素的方法构建慢性进行性肾脏损害的动物模型，结果发现，模型组尿蛋白增加，血清BUN，Cr升高，形态学呈现肾小球硬化改变，说明肾硬化模型制备成功. 与模型组相比，各干预组尿蛋白排泄量均明显减少，血BUN，Cr升高较晚（B组,C组直到27 wk才开始升高），肾小球系膜增生及硬化程度明显减轻，说明OM能明显改善阿霉素肾病鼠的尿蛋白水平及肾功能，抑制肾小球系膜增生及硬化，明显延缓肾小球硬化的病理进程. 实验发现OM 100 mg/(kg・d)的疗效优于50 mg/(kg・d)，其肾脏保护作用是否有剂量依赖性有待于增加不同浓度组进一步研究.

    本研究还发现模型组随着肾纤维化的进展，TGFβ1，Smad1, 2, 3, 5蛋白的表达逐渐增加，而Smad7蛋白的表达逐渐减少，推测Smad1, 2, 3, 5蛋白的表达增加及Smad7蛋白的表达减少可能为TGFβ1引起纤维化进程进展的主要原因. 与模型组相比，各干预组TGFβ1,Smad1, 2, 3, 5表达减少，而Smad7的表达增加，考虑OM抗肾纤维化的作用可能与干预TGFβ1/Smads信号传导通路有关.

    【】

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