乳腺癌中p73α和p53表达与化疗药物敏感性的关系

【关键词】  乳腺肿瘤

    Relationship between expression of p73α and p53 and chemosensitivity in breast cancer

　　【Abstract】 AIM:  To investigate the relationship between the expression of p73α and p53 in breast cancer cells and chemosensitivity. METHODS:  Twelve surgical samples of pathologically diagnosed breast cancer were used. The cancer cells were isolated and cultured in the incubator at 37℃, 50 mL/L CO2  in vitro. The inhibitory rates of cancer cells by 4 kinds of anticancer drugs (EPI, MMC, 5FU and DDP) were assayed by MTT method. Immunocytochemistry was used to detect the expression of p73α and p53 in the cancer cells. RESULTS:  The sensitivity of the 12 breast cancer cells in 0.1×PPC within 72 h in vitro was 42% (MMC), 33 % (EPI) and 17% (both 5FU and DDP). The inhibitory rates of MMC, EPI, 5FU and DDP were significantly higher in p73α positive cancer cells than in p73α negative cancer cells. A positive correlation was found between the expression of p73α and chemosensitivity in all the four anticancer drugs. CONCLUSION:  The expression of p73α is related to the chemosensitivity of the breast cancer cells and it can be used as one of the markers for clinical assessment of the effect of chemotherapy.

　　【Keywords】 breast neoplasms;  genes, p73α;  genes, p53; chemosensitivity

　　【摘要】 目的： 研究乳腺癌细胞p73α、p53表达与化疗药物敏感性的关系. 方法： 选取病理诊断为乳腺癌（术前未行放疗、化疗）的手术切除标本12例，体外分离细胞作培养，应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法分析表阿霉素（EPI）、丝裂霉素（MMC）、5氟脲嘧啶（5FU）、顺铂（DDP）4种化疗药物对乳腺癌细胞的相对抑制率，通过免疫细胞化学染色法分析乳腺癌细胞p73α、p53的表达. 结果： 0.1×PPC浓度时乳腺癌细胞对4种化疗药物的敏感率分别为MMC（42%）、EPI（33%）、5Fu（17%）、DDP（17%）；p73α（）的乳腺癌细胞对4种化疗药物敏感性均高于p73α（）的乳腺癌细胞（P<0.05），p73α阳性表达程度与乳腺癌细胞对EPI、MMC、5Fu、DDP4种化疗药物的敏感性存在正相关关系（r=0.736, P<0.05; r=0.744, P<0.05; r=0.674, P<0.05; r=0.721, P<0.05）. 结论： p73α的表达与乳腺癌细胞对化疗药物敏感性有关.
 
　　【关键词】 乳腺肿瘤；基因，p73α；基因，p53；化疗敏感性

　　0引言
 
　　乳腺癌临床化疗有效者能显著延长生存期，对化疗药物的抵抗被认为是乳腺癌化疗失败的原因之一. 目前对乳腺癌的化疗多是依据临床经验选择相应化疗方案，使存在盲目性，因此有必要寻找一些能对乳腺癌化疗疗效起预测作用的指标，以指导临床化疗提高疗效.  我们采用体外培养的人乳腺癌细胞，应用MTT法及免疫细胞化学染色法，研究p73α, p53表达与乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的关系如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　我院经病理诊断为乳腺癌，术前未经放疗、化疗的手术切除的新鲜癌组织12例，放入不含小牛血清的RPMI1640培养液中迅速送往实验室. 将表阿霉素(EPI)、丝裂霉素(MMC)、5氟脲嘧啶(5FU)、顺铂(DDP)分别用生理盐水配制成母液，再用培养液配成100×PPC浓度工作液（PPC是血浆峰值），正压过滤除菌，20℃保存.RPMI1640干粉培养基（Hyclone产品）;四甲基偶氮唑盐（MTT, Sigma产品）;100 mL/L小牛血清（杭州四季青）;二甲基亚砜（DMSO，分析纯为重庆化学试剂厂）；p73α兔抗人多克隆抗体（武汉博士德生物公司）；p53鼠抗人mAb、SP试剂盒 (北京中山生物技术公司).

　　1.2方法

　　采用机械法获取癌细胞单细胞悬液，先将标本用生理盐水（含青霉素300 ku/L、链霉素300 ku/L）反复冲洗，去除坏死组织和血凝块，置于无菌平皿中，加入少许培养液，用眼科剪反复剪切成糊状，200目不锈钢网过筛；经台盼蓝染色计数活细胞数≥95%；以1000 r/min离心10 min；用RPMI1640完全培养液（含100 mL/L小牛血清、含青霉素100 ku/L、链霉素100 ku/L）调整细胞浓度为5×107/L，接种于96孔板，每孔180 μL；接种细胞分别加入化疗药液20 μL（药物终浓度为10, 1, 0.1×PPC），每个浓度3个复孔；并设细胞对照组（加细胞不加药）和空白对照组（只加培养液），细胞对照组、空白对照组均加入培养液20 μL；置37℃，50 mL/L的CO2培养箱培养. 使用的药物为EPI，MMC，5FU和DDP，并按这些药物分组，每组12例.  加药培养68 h后，离心去上清，每孔加入RPMI1640完全培养液180 μL, MTT溶液20 μL再培养4 h，离心去上清，加入DMSO 200 μL，震荡15 min使沉淀充分溶解，用酶标仪（600 nm）测每孔吸光度（A）值，按下列公式相对抑制率：相对抑制率=（A对照-A加药）/A对照×100%. 根据0.1×PPC 浓度时的相对抑制率判定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，相对抑制率<30%为不敏感，30%~50%为敏感，>50%为中度敏感.   将肿瘤细胞涂于载玻片，晾干后用950 mL/L的酒精固定，置4℃冰箱备用. p73α、p53免疫细胞化学按照SP试剂盒说明书操作.   细胞质内出现棕色颗粒为 p73α阳性细胞，p53阳性细胞为细胞核内出现棕黄色颗粒；参照［1］标准：无阳性细胞或阳性细胞数<10%为（），阳性细胞数10%~50%记为（+），阳性细胞数51%~75%记为（），阳性细胞数>75%记为（）. 阳性细胞数≥10%均视为阳性表达.

 
　　统计学处理： 实验结果以x±s表示，采用SPSS11.5统计软件进行t检验、spearman等级相关分析等统计学处理. P<0.05视为差异有显著性意义.

　　2结果

　　2.1乳腺癌细胞体外药物敏感性检测10×PPC浓度时乳腺癌细胞平均相对抑制率为EPI（70±14）%, MMC（74±11）%, 5FU（63±7）%, DDP（65±12）%；1×PPC浓度时为EPI（45±10）%, MMC（47±5）%, 5FU（44±7）%, DDP（45±6）%；0.1×PPC浓度时 EPI（26±7）%, MMC（29±8）%, 5FU（24±6）%, DDP（25±8）%；随着药物浓度的升高，4种化疗药物对乳腺癌细胞的相对抑制率均逐渐升高. 在0.1×PPC浓度时乳腺癌细胞对4种化疗药物敏感率分别为MMC 42%, EPI 33%, 5FU 17%,  DDP 17%.

　　2.2p73α、p53表达与体外药物敏感性的关系乳腺癌细胞对4种化疗药物的敏感性均与p73α的表达相关，p73α阳性表达的肿瘤细胞对4种化疗药物敏感性高于p73α阴性表达的肿瘤细胞（Tab 1）；p73α的阳性表达程度与对EPI, MMC, 5FU, DDP4种化疗药物敏感性存在正相关关系（r=0.736, P<0.05; r=0.744, P<0.05; r=0.674, P<0.05; r=0.721, P<0.05）. p53的阳性表达程度未能显示出与乳腺癌细胞对4种化疗药物的敏感性相关（P>0.05, Tab 1）. 表1乳腺癌细胞p73α, p53表达与对化疗药物相对抑制率的关系（略）

　　3讨论
　　
　　本结果显示，随着化疗药物浓度升高，乳腺癌细胞的相对抑制率也逐渐升高，对药物的敏感率也逐渐升高；MMC, EPI作为较敏感的药物有不敏感的个体，5FU, DDP作为不敏感药物也有敏感个体，有4例乳腺癌细胞对4种化疗药物均不敏感. 可见化疗个体化原则的重要性.p73α能通过诱导p21蛋白生成等途径促进凋亡［1］. Gong等［2］发现顺铂能通过cAbl激酶途径延长p73α蛋白的半衰期，增强p73α促进凋亡的能力； Truong等［3］发现化疗杀死p53阴性的肿瘤细胞能被cAbl或p73途径激活所加强. Zhu等［4］研究显示p73α能增强由化疗药物诱导的MCF7细胞株的凋亡，能与顺铂等DNA损伤剂共同诱导p53靶基因的产生，能以依赖p53基因的途径在MCF7细胞株中联合DNA损伤剂导致凋亡诱导的加强. 何勇等［5］利用脂质体转染技术将野生型p73α基因导入p53基因纯合缺失的人肺腺癌细胞株H1299，发现p73基因表达增强可以使肺腺癌细胞对DNA损伤剂化疗药物的敏感性显著升高. 另外，我们未发现p53表达与乳腺癌对化疗药物敏感性之间的相关性，究其原因可能是化疗诱导的肿瘤细胞凋亡包括p53依赖和非p53依赖两条途径，Kim等［6］发现docetaxel可通过诱导转录因子AP1，激活其下游的gadd153， p21WAF1等来诱导胃癌细胞凋亡，且凋亡的发生与p53突变状态无关，因而认为化疗药物诱导的的非p53依赖性的胃癌细胞凋亡可能是通过AP1介导的.

　　【】

　　［1］ Weber A, Bellmann U, Bootz F, et al. Expression of p53 and its homologues in primary and recurrent squamous cell carcinomas of the head and neck［J］ . Int J Cancer, 2002; 99(1) : 22-28.

　　［2］ Gong JG, Costanzo A, Yang HQ, et al. The tyrosine kinase cAbl regulates p73 in apoptotic response to cisplatininduced DNA damage ［J］. Nature, 1999; 399(6738) : 806-809.

　　［3］ Truong T, Sun G, Doorly M, et al. Modulation of DNA damage induced apoptosis by cell adhesion is independentedly mediated by p53 and cAbl ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003; 100(18):10281-10286.

　　［4］ Zhu J,  Nozell S, Wang J, et al. P73 cooperates with DNA damage agents to induce apoptosis in MCF7 cells in a p53dependent manner ［J］ . Oncogene, 2000; 20(30): 4050-4057.

　　［5］ 何勇，范士志，蒋耀光，等.  P73基因对人肺腺癌细胞H1299化疗敏感性的影响［J］. 癌症，2004;23（6）：645-649.
  
　　He Y, Fan SZ, Jiang YG, et al. Effect of p73 gene on chemosensitivity of human lung adenocarcinoma cells H1299 ［J］. Cancer, 2004, 23(6):645-649.

　　［6］ Kim R, Ohi Y, Inoue H, et al. Taxotere activates transcription factor AP1 in assiciation with apoptotic cell death in gastric cancer celllines［J］. Anticancer Res, 1999; 19(6B):5399-5405.