Epstein
【关键词】 鼻咽肿瘤
Expression of EpsteinBarr virus RPMS1 gene in nasopharyngealcarcinoma and its subcellular location in vitro
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of RPMS1 mRNA in biopsies of nasopharyngeal carcinoma (NPC) in the area with high incidence and to observe the subcellular fraction of its encoding protein. METHODS: DNA and total RNA were isolated from tissues and cells. Nested PCR was designed to amplify the W sequence of EBV DNA and RTPCR was used to analyze the transcription of RPMS1 in all samples. RPMS1 coding sequence (CDS) amplified from NPC tissues was cloned into pEGFPC2. After transfected with this recombinant plasmid by lipofectin mediation, HEK293 cells were analyzed by RTPCR and laser confocal microscope to observe the expression of RPMS1 and its subcellular fraction. RESULTS: Except for BJAB cells, EBV W sequence was observed in all the samples. RPMS1 expressed in 83.3%（45/54） NPC biopsies and 4%（1/25）noncarcinoma nasopharynx biopsies with significant difference between them but no RPMS1 mRNA was detected in peripheral lymphocytes of NPC. RPMS1 expressed at lower level in Raji than in SUNE1 and was not expressed in B95.8 cells. The recombinant plasmid was constructed and expressed stably in HEK293 cells, in which the fusion protein was found to be nuclear. CONCLUSION: EBVRPMS1 gene is expressed in NPC tissues in the area with high incidence and its encoding protein can stably express in cytoplasm of epithelial cell in vitro, suggesting that RPMS1 may function as a nuclear transcriptional factor by regulating the signal conduction related with cellular proliferation.
【Keywords】 nasopharyngeal carcinoma; EpsteinBarr virus; RPMS1; green fluorescence protein
【摘要】 目的：了解RPMS1基因在鼻咽癌组织中的表达特点，并明确该基因在上皮细胞中表达的亚细胞区域，为进一步研究其生物学功能提供依据. 方法：提取鼻咽癌组织及各细胞系的DNA和总RNA，以巢式PCR扩增W片段来检测EpsteinBarr病毒（EB病毒）的感染情况，RTPCR检测RPMS1基因在鼻咽癌组织、细胞株中的表达，并克隆入pEGFPC2真核表达载体，通过脂质体转染技术将其介导入人胚肾上皮（HEK293）细胞，以激光共聚焦显微镜观察其蛋白表达的亚细胞区域. 结果：除BJAB细胞株外，所有标本中均检测到EB病毒W片段；RPMS1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达率为83.3%（45/54），在鼻咽非癌组织中则仅为4%（1/25），二者有显著性差异（P<0.001），鼻咽癌外周血淋巴细胞中未检测到RPMS1表达，RPMS1在SUNE1细胞中的表达高于Raji细胞，但不表达于B95.8细胞；RPMS1可稳定表达于HEK293细胞，其编码蛋白的表达以胞核为主. 结论：EB病毒RPMS1基因在高发区鼻咽癌组织中存在高水平转录，在体外可稳定表达于上皮细胞的胞核，提示RPMS1编码蛋白可能作为核转录因子通过调控细胞增殖相关的信息传递而参与上皮癌变过程.
【关键词】 鼻咽肿瘤；EpsteinBarr病毒；RPMS1基因；绿色荧光蛋白
0引言
EB病毒的潜伏感染与多种肿瘤的发生相关，尤其与鼻咽癌关系密切，属Ⅰ类致癌物［1］. BARTs是EB病毒潜伏感染时表达最为广泛的基因家族之一. BARTs转录于EB病毒潜伏感染的多种细胞和肿瘤，尤其高表达于上皮细胞和上皮源性肿瘤如鼻咽癌［2,3］，在淋巴细胞中却呈低水平表达或不表达 ［3,4］，提示该基因在EB病毒的生物学活动中可能具有重要作用. 目前尚不清楚RPMS1基因在高发区鼻咽癌组织中的表达状况、编码蛋白质的亚细胞定位及其生物学功能. 我们检测RPMS1基因在广东高发区鼻咽癌组织中的表达，并构建该基因的融合表达质粒，以绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）为标记物观察该基因编码蛋白质在上皮细胞中表达的亚细胞区域，为进一步研究该基因的生物学特性及其作用机制提供依据.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1鼻咽活检组织、细胞、质粒和菌株鼻咽活检组织和血液标本来自中山大学肿瘤收治的患者. 鼻咽癌54例，主要为低分化鳞癌；鼻咽非癌对照25例，均为黏膜慢性炎症. 鼻咽癌患者外周血14例. 所有病例均经病检查确诊. 各细胞系：SUNE1为鼻咽癌体外传代细胞系，B958为EB病毒转化的枭猴B淋巴细胞系，Raji为EB病毒阳性的Burkitts淋巴瘤细胞系，BJAB为EB病毒阴性的Burkitts淋巴瘤细胞系，人胚肾上皮（human embryo kidney, HEK293)为腺病毒体外永生化的人胚肾上皮细胞系. JM109大肠杆菌和pGEMT easy vector购自Promega公司；pEGFPC2质粒购自Clontech公司.
1.1.2主要试剂应用试剂包括TRIzol Reagent （Gibco），Reverse Trancription System （Promega），T4 DNA连接酶、BamH I和Hind III限制性内切酶（Takara），LipofectAMINE 2000 Reagent（Invitrogen）. 质粒抽提试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27104)和DNA回收纯化试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit（Cat.No.28704）为QIAGEN公司产品. Taq Plus DNA聚合酶购自上海生工公司.
1.1.3引物设计与合成根据GenBank提供的相关序列，应用软件Primer Primier 5.0设计引物，由上海生工公司合成. EB病毒DNA BamH I W片段巢式PCR引物：外巢上游引物5′ GCCAGAGGTAAGTGGACTTT 3′,下游引物5′ TGGAGAGGTCAGGTTACTTA3′，扩增长度240 bp，内巢上游引物5′ TTCTGCTAAGCCCAACACTC 3′,下游引物5′ CTGAAGGTGAACCGCTTA 3′，扩增长度192 bp；RPMS1上游引物：5′ CCCAAGCTTCATGGCCGGAGCTCGTCGAC 3′，下游引物：5′ CGCGGATCCGCGCCGCTTTGTCCTGGAC 3′，其5′端分别引入Hind III和BamH I酶切位点及保护碱基，扩增长度360 bp；内对照GAPDH，上游引物：5′ AATCCCATCACCATCTTCCA 3′,下游引物: 5′ CCTGCTTCACCACCTTCTTG 3′，扩增长度580 bp. RPMS1和GAPDH引物扩增片段均跨两个以上外显子.
1.2方法
1.2.1巢式PCR分析初级PCR反应：25 μL的反应体系含上述提取的模板DNA 0.5 μg，10×PCR缓冲液2.5 μL，10 μmol/L的dNTP 0.5 μL，10 μmol/L的外巢上下游引物各0.5 μL，5×106 U/L的Taq Plus DNA聚合酶0.25 μL. 反应条件为95℃预变性2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环后72℃延伸7 min. 次级PCR反应：将初级PCR反应产物稀释50倍取2 μL作为次级PCR模板，20 μmol/L的内巢上下游引物各0.5 μL，退火温度改为57℃，其他条件同上. 取5 μL PCR产物上样于16 g/L的琼脂糖凝胶电泳进行分析.
1.2.2总RNA提取和RTPCR鼻咽活检组织进行匀浆处理，按常规方法从外周血中分离淋巴细胞. 其总RNA的提取按照TRIzol试剂使用说明操作，所提RNA以无RNase活性的DNase消化以除去残留的基因组DNA，紫外分光光度仪定量，2 μL上样电泳鉴定质量，-70℃保存备用. 反转录体系及方法按照前述试剂盒说明进行. PCR反应体系：含上述cDNA 1 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，10 μmol/L的dNTP 0.5 μL，10 μmol/L的GAPDH上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/L的RPMS1上、下游引物各0.5 μL, 55×106 U/L的Taq Plus DNA聚合酶0.25 μL, 加水至25 μL. 反应条件为95℃预变性2 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，28个循环后72℃延伸7 min. GAPDH引物可于开始3个循环后加入. 取5 μL PCR产物于16 g/L的琼脂糖凝胶电泳进行分析.
1.2.3pGEMT easy/RPMS1重组质粒的构建与鉴定以PCR从鼻咽癌cDNA中扩增RPMS1编码序列全长，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并纯化后，与pGEMTEasy克隆载体连接，转化JM109大肠杆菌，氨苄青霉素（100 mg/L）筛选，挑取阳性单菌落扩增培养，提取质粒，以PCR，BamH I和Hind III双酶切及测序进行鉴定. 重组质粒的构建：分别以双酶消化pGEMTEasy/RPMS1和pEGFPC2，此后，酶切产物的电泳、切胶及回收纯化过程、连接反应及其产物的转化、筛选（卡那霉素50 mg/L）以及重组质粒的提取、鉴定等过程均同上. 反应体系、反应条件及详细操作参照试剂使用说明.
1.2.4细胞培养和转染以RPMI 1640（含100 mL/L胎牛血清）常规培养细胞（37℃，50 mL/L CO2）. 细胞转染：收集对数生长期的HEK293细胞，以6×105/孔接种于6孔培养板，待细胞长至90%接触时换无血清RPMI 1640 2 mL备用. 分别以250 μL无血清的RPMI 1640溶解4 μg的质粒DNA和稀释5 μL的LF2000 Reagent，混合后置室温下孵育20 min，分别加入已准备好的各组细胞并混匀，常规培养6 h后换全培养基继续培养，24～48 h内可进行瞬时分析，48 h后更换选择性培养基（含G418 200 mg/L）筛选稳定表达克隆，约2 wk时（对照组细胞基本死亡），挑取实验组阳性克隆，逐步扩大培养，RTPCR鉴定后建立稳定传代的细胞系，仍以选择性培养基（G418 200 mg/L）传代培养.
1.2.5转染细胞中融合蛋白表达的观察采用激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP）对瞬时和稳定转染后的细胞进行荧光观测，并确定其表达的亚细胞区域，以机进行成像分析.
统计学处理：χ2检验，采用SPSS 10.0软件进行数据处理.
2结果
2.1EB病毒BamHI W片段的检测在鼻咽活检组织、外周血淋巴细胞和除阴性对照BJAB外的所有细胞株中均检测到了192 bp的EB病毒BamHI W片段（Fig 1），表明EB病毒感染在各标本中广泛存在.
2.2RPMS1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达RPMS1基因在鼻咽癌组织中的表达率为83.3%（45/54），在鼻咽非癌组织（黏膜慢性炎症）中仅为4%（1/25），二者有显著性差异（P<0.001, Fig 2A)；14例鼻咽癌外周血淋巴细胞中未检测到RPMS1 (Fig 2A)；鼻咽癌细胞株SUNE1中RPMS1的表达高于Raji细胞(Fig 2B)，不表达于B95.8细胞，表明RPMS1基因高表达于鼻咽癌组织和细胞株，在淋巴细胞株中表达较低，在鼻咽癌外周血淋巴细胞中不表达.
2.3RPMS1基因的克隆及其重组质粒的鉴定将RPMS1基因克隆入pGEMT easy载体，鉴定后亚克隆入pEGFPC2，成功建立重组表达质粒pEGFPC2/RPMS1，PCR及BamH I和Hind III双酶切鉴定均可见到360 bp的扩增片段(Fig 3)，与理论设计长度相符，该重组质粒可用于下一步的细胞转染研究.
2.4RPMS1在HEK293细胞中的表达及其定位以pEGFPC2/RPMS1重组质粒转染HEK293细胞，可见瞬时（24 h）和稳定转染（第20代）的细胞中均出现RPMS1 mRNA（Fig 4）及其融合蛋白表达，在激光扫描共聚焦显微镜下，可以清晰地观察到RPMS1融合蛋白呈斑片状表达于细胞核（Fig 5A），当以红色为其阳性背景时，黄色为其最强表达，同样观察到RPMS1融合蛋白表达于细胞核（Fig 5B），而空载体转染组细胞中GFP的绿色荧光在整个细胞中均一表达（Fig 5C），未转染组细胞无绿色荧光出现（Fig 5D）.
3讨论
RPMS1基因是BARTs家族唯一确定了全长cDNA结构的成员， 其编码结构由BARTs基因第Ⅳ,Ⅴ
1外显子剪接而成，属该家族最丰富的转录剪接形式［3,4］. 我们的前期工作曾发现其编码序列的151 nt发生碱基替换（g→a），导致相应的第51位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰氨（D→N），该结果与本研究室在其第Ⅴ外显子155849 nt位点发现的高频变异相一致，编码序列的变异高度提示该基因参与鼻咽上皮的癌变过程. 我们发现RPMS1基因在高发区鼻咽癌组织中存在高水平转录，与鼻咽非癌组织相比差异显著（P<0.001），高度提示该基因与高发区鼻咽癌的发生相关；RPMS1在鼻咽癌细胞系SUNE1中高水平表达，但在Raji细胞中表达下调，在B95.8细胞中则不表达，在鼻咽癌外周血淋巴细胞中也未检测到该基因转录，该结果与目前报道基本一致［5］，表明RPMS1可能主要参与EB病毒在上皮细胞中的生物学活动.
GFP是目前广泛应用于活细胞和组织内基因表达及蛋白定位的一种新型分子标记物，可以快速而准确地指示融合蛋白的表达及其部位［6］，结果显示RPMS1融和蛋白可稳定表达于上皮细胞的胞核，提示RPMS1蛋白可能以细胞核为其功能活动区域. RPMS1编码蛋白与转录因子CBF1存在相互作用［5,7］，通过与Notch IC竞争性结合CBF1从而维持其转录抑制功能，继而抑制Notch通路活性，而EB病毒另一重要基因EBNA2正是通过与Notch IC竞争结合CBF1、进而抑制Notch IC活性来发挥其永生化B细胞的功能［8］. 进一步的研究表明，RPMS1可通过与CBF1及其辅阻遏物CIR的相互作用而负性调节Notch/ EBNA2信号通路活性［7］. 因此，RPMS1蛋白的核内表达进一步表明RPMS1可能作为核转录因子通过调控相关通路活性参与细胞的生长转化过程.
RPMS1的表达特点及其定位信息表明该基因可能参与上皮癌变过程，并与高发区鼻咽癌的发生发展有密切关系. 本研究为进一步研究RPMS1的生物学功能及其参与鼻咽癌变的分子机制奠定了基础.
【】
［1］ Nieboditek G. The EpsteinBarr virus: A group 1 carcinogen? ［J］. Virchow Arch, 1999; 435:79-86.
［2］ Imai S, Nishikawa J, Takada K. Celltocell contact as an efficient mode of EpsteinBarr virus infection of diverse human epithelial cells ［J］. J Virol, 1998; 72: 4371-4378.
［3］ Smith P. EpsteinBarr virus complementary strand transcripts (CSTs/BARTs) and cancer ［J］. Semin Cancer Biol, 2001;11:469-476.
［4］ Smith P, De Jesus O, Turner DJ, et al. Structure and coding content of CST (BARTs) family RNAs of EpsteinBarr virus ［J］. J Virol, 2000; 74(7): 3082-3092.
［5］ Chen H, Smith P, Ambinder RF, et al. Expression of EpsteinBarr virus BamHI A rightward transcripts in latently infected B cells from peripheral blood ［J］. Blood, 1999; 93(9): 3026-3032.
［6］ Anna C, Elena R, Valeria T, et al. Recombinant aequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signaling ［J］. Biochem J, 2001; 355: 1-12.
［7］ Zhang J, Chen HL, Weinmaster G, et al. EpsteinBarr virus BamHIA Rightward Transcriptencoded RPMS protein interacts with the CBF1associated corepressor CIR to negatively regulate the activity of EBNA2 and Notch IC ［J］. J Virol, 2001; 75: 2946-2956.
［8］ Hsieh J, Henkel T, Salmon P, et al. Truncated mammalian Notch1 activates CBF1/RBPJrepressed genes by a mechanism resembling that of EpsteinBarr virus EBNA2 ［J］. Mol Cell Biol, 1996; 16: 952-959.
