Cystatin C在诊断肾功能损害中的应用及其新进展

    【关键词】 胱蛋白酶抑制剂C；肾功能损害；诊断

　　1肾功能损害的常用测定指标

　　肾小球的主要功能是滤过作用，临床上常用的测定肾小球滤过功能的指标有血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、内生肌酐清除率(Ccr)、血β2微球蛋白(β2M)和视黄醇结合蛋白(RBP). 这些指标虽然在临床上广泛应用，但它们仍有一定的局限性，且常受一些肾性和肾外因素的影响，如BUN在肾小球功能轻度受损时可无变化，且受蛋白质摄入量和体内蛋白质分解代谢的影响；Scr也不能作为肾脏损害的早期指标，其水平受肌肉量，肉食的摄入量和体内代谢水平的影响；Ccr是反映肾小球滤过功能的敏感指标，当Ccr下降到80%以下时，Scr和BUN可正常，但肾小管分泌少量肌酐，会使测定结果偏高，在病理状态下其生成速度也会增快，使测定结果不准确. 近年来，同位素标记物清除率的测定方法已被广泛使用，但由于放射缘故，使其临床应用受限. 国外报道较多的有非粒子造影剂iohexol（碘海醇）血浆清除率测定，其准确性和同位素相当，是目前较理想的方法，但以上方法需要留取尿液，并且价格昂贵，需要一定的仪器设备，难以作为常规测定指标.

　　2一种新的肾功能测定指标胱蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)

　　Cystatin C是一种非糖基化的碱性蛋白质，主要分布于细胞外液中，脑脊液中浓度最高，尿中的浓度最低. 它含有120个氨基酸，相对分子质量Mr=13 359，人体所有的有核细胞都可以持续的产生Cystatin C. 其产量不受其他因素（如年龄、性别、饮食、炎症等）的影响. 肾脏是Cystatin C的主要分解代谢器官，低分子量和高等电点（PI=9.3）使其能自由的通过肾小球基底膜，而且在近端肾小管几乎全部被重吸收和分解代谢.

　　Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一种，在肽链C端有两个二硫键. Cystatin C基因属看家基因，它在人体组织中能被稳定的表达. Cystatin C的一些基因型和其基因的多态性与某些肿瘤的发生有关. 因此，Cystatin C不仅可以作为判断肾小球滤过率(GFR)的分子指标，也可以作为癌症患者潜在的GFR的分子指标，并且不受化疗的影响.

　　3Cystatin C与其他指标的比较

　　Crubb［1］将51crEDTA测定的GFR与血清Cystatin C和Scr相比较，其相关系数r分别为0.77和0.75. Bokenkamp等［2］将菊粉测定的GFR与血清Cystatin C和Scr比较，相关系数r分别是0.88和0.72；用碘海醇法测定的GFR与血清Cystatin C和Scr比较，相关系数r分别是0.87和0.71. 以上研究表明，Cystatin C与GFR比Scr与GFR有更好的相关性. 李玉林等［3］用乳胶增强的免疫散射法测Cystatin C，还分别测了Scr和Ccr，并比较了它们之间的相关性，结果发现血清Cystatin C与Scr有显著正线性相关（P<0.001），与Ccr的对数值呈显著负线性相关：Log Cystatin C=-0.606Log Ccr+1.209(r=-0.887)；沈清等［4］用ELISA法测Cystatin C，并分析各指标之间的相关性发现，血清Cystatin C与Ccr呈显著负相关（r=-0.774），血清Cystatin C与Scr呈显著正相关（r=0.709），Scr与Ccr呈显著负相关（r=-0.674），血清Cystatin C与Ccr的相关性高于Scr与Ccr的相关性.

　　4Cystatin C 诊断肾功能损害的敏感性和特异性

　　Risch等［5］对30例曾行肾移植现处于稳定状态者（男女各半）检测其血清Cystatin C，Scr，Ccr和B2微球蛋白，发现Cystatin C和GFR的相关性最好（r=0.83），Scr(r=0.67), Ccr(r=0.57)和β2微球蛋白(r=0.58),均不如Cystatin C； Erlandsen等［6］采用粒子增强比浊免疫法测47例非胰岛素依赖型糖尿病患者的Cystatin C，Scr和Ccr，相关曲线(ROC)分析表明，Cystatin C诊断的灵敏度明显高于Scr和Ccr. Cystatin C最好的诊断率（98%）时其截断点应设在1.32 mg/L；Jong等［7］对癌症化疗患者进行早期肾损伤检测，发现Cystatin C和Ccr有很大的相关性， Cystatin C比Ccr更敏感（r=0.84，P=0.01），如果以1.33 mg/L的Cystatin C为截断点，检测小于78 mL/min Cystatin C的Ccr时，Cystatin C的灵敏度为87%，特异性为100%，回归分析表明，检测Cystatin C比Ccr更好.

　　沈清等［4］用ELISA法分析185例不同程度的肾病患者（按Ccr值分组）发现，Ccr小于80 mL/min的患者中，93%的患者Cystatin C高于正常，而84%的患者Scr高于正常，Ccr在50~79 mL/min之间的患者组中，77%的Cystatin C高于正常，58%的Scr高于正常，Ccr在25~49 mL/min之间的患者中，有100%的患者Cystatin C高于正常，而只有87%的患者Scr高于正常，在Ccr高于80 mL/min的患者中，有95%的Cystatin C在正常范围内，有100%的患者Scr在正常范围. 由此发现，Cystatin C对肾功能损害，尤其是早期肾损的患者，比Scr更敏感. 李玉林［3］分析不同年龄不同性别的患者发现，Cystatin C在男性组和女性组不同年龄间无显著差异（P>0.05），对Ccr异常的患者，Cystatin C比Scr有更显著的符合率. 由此可见，Cystatin C在诊断肾功能损害上有以下特点：①有稳定的生成速度，不受年龄、性别和其他病理状态的影响；②能自由地被肾小球滤过；③不被肾小管重吸收和分泌.

　　5Cystatin C的测定方法

　　自从Price等［8］在脑脊液中发现Cystatin C后，许多学者致力于寻找一种更快速、更准确的Cystatin C测定方法. 1979年Grubb等［1］提出了酶放大免疫扩散法，这种方法比较繁琐，不适用大批量测定. 随后，随着各种免疫方法的不断完善，1993年Coll等［9］提出了酶联免疫吸附法（ELISA），ELISA 法是一种定量检测Cystatin C的方法，它以包被固相载体的兔特异性多克隆抗体为第一抗体，加入待测血清后，再加入辣根过氧化物酶标记的鼠抗人Cystatin C的第二抗体，孵育后加入发光基质底物，450 nm处显色. 该方法大大提高了Cystatin C检测的灵敏度，其最低可测限为0.02 nmol/L，分析时间需要4.5 h. 1995年Bowers等［10］提出的粒子增强比浊法使Cystatin C测定更上了一个台阶，其分析时间缩短到10 min，在浓度为1.5 mg/L时，其精确度为批内平均CV=2.6%，批间平均CV=6.6%，在浓度为5.8 mg/L时，批内平均CV=0.9%，批间平均CV=3.2%. 最近，德灵公司又提出了乳胶增强的散射免疫比浊法测Cystatin C，它是以多克隆兔抗体为基础的改良免疫比浊分析法，它以人尿中纯的Cystatin C定标，血清和肝素抗凝血浆均可用，整个分析过程只需要6 min，测定范围为0.87~4.63 mg/L，在浓度为0.25~7.90 mg/L范围内，批内CV<1.8%，批间CV<1.8%. 在整个测定范围内，理论值与实际值有良好的相关性.

　　6Cystatin C的临床应用新进展

　　6.1Cystatin C在淀粉样蛋白沉积性血管病(HCCAA)病因学研究中的应用遗传性Cystatin C HCCAA是一种常染色体显性遗传病，由于脑动脉内淀粉状蛋白纤维沉积，引起颅内反复出血，导致中风、精神错乱、甚至死亡. HCCAA的发病机制至今还不是十分清楚.最近有研究发现，HCCAA的发病与Cystatin C的基因突变紧密相关. Asgeirsson等［11］测定HCCAA患者脑脊液中Cystatin C水平并与健康人对照发现，HCCAA患者脑脊液中Cystatin C浓度仅为健康人的1/3，从HCCAA患者中分离出单核细胞进行体外培养发现，HCCAA患者单核细胞分泌Cystatin C的能力远远低于健康对照，但其细胞内Cystatin C mRNA的转录活性并没有受限，初步估计HCCAA是由于Cystatin C突变株分泌减少，甚至不分泌，从而在细胞内积聚，形成淀粉状纤维丝. 通过对Cystatin C突变株基因型分析发现，Cystatin C的基因突变发生在第68个氨基酸上，由谷氨酸取代了原来的亮氨酸. 进一步研究发现，Cystatin C突变株不仅由Leu变为Gln，且其N端有10个氨基酸被截断，这可能是脑动脉内淀粉状纤维丝沉积的又一个因素，还需要进一步研究.

　　6.2Cystatin C在胸膜疾病病因学研究中的应用引起胸膜疾病导致胸腔积液的原因很多，急性或慢性肾病造成肾功能损害是发生胸膜疾病的一个主要因素，有研究表明，尿毒症患者往往因体液免疫和细胞免疫减弱，导致胸膜性肺炎. 长期作腹膜透析和血液透析的患者也会发生各种胸膜疾病. 但究其发病根源，却没有一种更快速敏感的指标，Cystatin C是最近才发现的一种新颖的胸膜疾病病因学诊断指标.Wolfgang等［12］测定47例患者（其中17例肾功能损害、11例肝硬化、8例充血性心衰、6例转移癌、其他为不明原因的胸水）胸水和血液中的Cystatin C，B2M，磷酸盐、肌酐以及总蛋白，并血清Cystatin C/胸水Cystatin C值. 结果发现，仅在肾功能损害的患者组中，Cystatin C与胸水Cystatin C浓度接近，其比值约为1.0，其他组中，若血清Cystatin C高，胸水Cystatin C就比较低，胸水Cystatin C高，血清Cystatin C则比较低. 该发现第一次由Wolfgang等［12］报道，其研究还有待深入.

　　6.3Cystatin C在动脉硬化和大动脉瘤病因学研究中的应用人类动脉硬化和腹部大动脉瘤的发病机制来源于弹性薄层的分解，弹性半胱氨酸蛋白酶S和K，它们在动脉弹性蛋白损害部位超量表达. Shiraishi等［13］研究发现，动脉硬化和大动脉瘤患者体内缺乏Cystatin C，并且通过B超发现，腹部动脉瘤直径越大，血清Cystatin C浓度越低.体外实验发现，细胞分裂刺激血管平滑肌细胞分泌组织蛋白酶，但是TGFbeta，诱导Cystatin C分泌时，组织蛋白酶弹性作用受阻. 这些表明动脉硬化和腹部大动脉瘤是由于半胱氨酸蛋白酶和Cystatin C不平衡最终导致Cystatin C缺乏.

　　6.4Cystatin C的其他应用Filer等［14］发现哮喘患者血清Cystatin C浓度明显升高，提示Cystatin C可能与哮喘的发病机制有关，甲基强的松可使血清Cystatin C升高，而环胞霉素A可能使Cystatin C浓度降低. Coll等［9］研究恶性黑色素瘤时发现，构建的Cystatin C真核表达载体经转染恶性黑色素瘤细胞素B16后，改变B16的体外生长状态及经尾静脉注射后的小鼠肺部肿瘤的形成率. Cystatin C蛋白活性下降很可能与癌症的早期局部浸润和远端转移有关.

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