过敏性休克死亡豚鼠脏器中IgE蛋白表达

【关键词】  过敏性反应

    【摘要】  目的： 检测过敏性休克死亡豚鼠脏器中IgE的蛋白表达情况，探讨法医学鉴定过敏性休克的病理形态学诊断标准. 方法： 建立豚鼠异种血清过敏性休克模型，利用组织芯片技术、采用免疫组化方法SP法检测25例过敏性休克死亡鼠脏器中IgE蛋白的表达情况,并与常规切片比较. 结果： 过敏性休克死亡豚鼠在肺小血管壁及其血管周围 ，气管黏膜上皮内、小血管壁及结缔组织和脾髓质中IgE蛋白呈阳性表达，而肝、肾、心等脏器中IgE蛋白表达呈阴性. 结论： 过敏性休克时，肺、气管和脾组织中可检见IgE.

　　【关键词】  过敏性反应；IgE；组织芯片技术；免疫组织化学；豚鼠

　　0引言

　　过敏性休克是Ⅰ型变态反应，少数短时间内发生死亡［1］. 豚鼠在致敏后血清总IgE明显升高，抗原再次攻击前血清IgE抗体明显高于再次攻击后休克死亡者，提示IgE可能在组织中存留. 我们在200401/200410利用组织芯片技术、采用免疫组化方法检测过敏性休克死亡豚鼠脏器中IgE的表达情况，并与常规病理技术进行比较.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　多人混合的正常血清，井冈山学院2003级妇幼班部分学生提供. 纯种Hartly豚鼠40只，雌雄不拘，体质量200~250 g，随机分为正常对照组（8只）和实验组(32只)，由江西医学院实验动物中心提供. 兔抗人IgE抗体、SP试剂盒及DAB显色液均购自Dako生物技术有限公司武汉分公司. 过敏性休克动物模型的建立参照 ［2］. 实验组豚鼠的一侧后爪掌皮内注致敏原0.15~0.20 mL,形成皮丘. 致敏后饲养20 d后（饲养期间共死亡5只，其中实验组4只，对照组1只）于胸前区搏动最明显处刺入心腔，见有搏动性回血后注射人血清1 mL，诱发过敏性休克，休克发生率100%，死亡率89.3%. 取心、肺、肝、肾、脾、胃、肠、甲状腺、气管等组织，40 g/L甲醛液固定，备作组织芯片，行HE染色和免疫组化染色. 对照组豚鼠的一侧后爪掌皮内注射生理盐水0.15~0.20 mL，饲养20 d后，心腔内注射生理盐水1 mL，未出现上述过敏症状，未死亡. 断头处死后取组织作上述处理.

　　1.2方法

　　组织芯片的制备参照文献［3］，用手工方法制作组织芯片. 免疫组化染色SP法染色按试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗、二抗、抗生素蛋白链霉亲和素辣根过氧化物酶作对照. 在光学显微镜下对切片IgE染色阳性情况进行半定量评估，阳性反应呈棕黄色，定位于细胞质、血管壁及结缔组织内. 评分标准： ① 按细胞显色有无及深浅计分： 无显色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分. ② 按显色区域的比例计分： 无显色区域0分，显色区域10%~15% 1分，显色区域16%~50% 2分，显色区域51%~100% 3分. 再以两项计分之积判断结果： 2分以下为阴性（-），2分为弱阳性（＋），3分为阳性（），4分以上为强阳性（）. 统计学处理采用秩和检验.

　　2结果

　　实验组豚鼠均于抗原攻击后0.5~1 min开始出现活动减少，继而竖毛，躁动，呼吸困难，四肢软弱，抽搐，大小便失禁，最后25只豚鼠死亡；3只豚鼠症状逐渐缓解. 死后解剖检查，肉眼所见： 实验组和对照组各脏器均呈现急骤死亡的一般病理改变；镜下所见： 实验组在肝、肾、脾间质及气管与胃肠黏膜下见少量嗜酸性粒细胞浸润，对照组未见嗜酸性粒细胞浸润，实验组肺水肿较对照组明显. 在9个组织芯片中，对照组7例，在肺、肝、肾、脾、胃、肠等9个脏器组织均呈阴性反应；实验组25例，肺小血管壁及血管周围均出现浅黄色或棕黄色阳性区域，气管黏膜上皮细胞质、小血管壁及结缔组织出现浅黄色或棕黄色区域；脾髓质出现浅黄色区域和棕黄色阳性细胞；心、肝、胃、肠等脏器组织无显色. 常规病理切片的肺、气管、肾、脾等4个脏器组织行免疫组化SP染色，对照组所有脏器组织呈阴性反应，实验组休克死亡25例肺小血管壁及血管周围均出现浅黄色或棕黄色阳性区域，气管黏膜上皮细胞质、小血管壁及结缔组织出现浅黄色或棕黄色区域；脾髓质出现浅黄色区域和棕黄色阳性细胞；心、肝、胃、肠等脏器组织无显色. 组织芯片免疫组化染色与常规病理切片免疫组化染色比较，阳性强度及范围均基本一致，无显著性差异（P>0.05，表1）.表1组织芯片与常规病理切片免疫组化染色结果比较（略）

　　3讨论

　　临床大量实践证实，各种类型的变态反应血清中总IgE均升高［4］. 我们在肝、心、肾等组织均末检出IgE，在肺、气管、脾等组织中检出多量IgE，提示肺、气管可能是过敏性休克中受累最重的器官. 肺、气管、脾检出IgE可能有助于从病理形态学角度诊断过敏性休克. 组织芯片容纳的信息量大，省时、省力、节约试剂，又减少了实验误差. 而且这两种方法免疫组化标记结果基本一致（P>0.05），与Fernebro等［5］比较20例直肠癌组织微阵列和大切片p53蛋白表达的结果一致. 本实验576个阵列点，有效点数91%. 比［6］报道的组织微阵列制作效率已从早期的70%左右提高到了90%略高，可能是与本次实验取之新鲜组织而不是存档蜡块组织有关. 我们认为，可从组织选取、阵列蜡块制作和切片等多个环节加以改进，方可提高组织微阵列制作的效率.

　　【文献】

　　［1］ 左止津，祝家镇. 过敏性休克死亡体内白三烯变化的研究 ［J］. 法医学杂志,1992;7(3):141.

　　［2］ 郭薇，陈玉川，成建定，等. 豚鼠过敏性休克IgE 和C5复合物分布及Ckit蛋白表达［J］. 中山医科大学学报,2002;23（2）：103-104.

　　［3］ 赵坡， 辛茂，王德文. 用引物介导原位标记方法检测脑胶质瘤染色体畸变［J］. 中华病杂志，1996；25：291.

　　［4］ 周亦武. 药物过敏性休克的病理变化及其法医学鉴定［J］. 中国法医学杂志,1993;5（3）:167.

　　［5］  Fernebro  E, Dictor  M, Bendahl  PO, et al. Evaluation  of  the tissue  microarray  technique  for  immunohistochemical analysis in rectal cancer ［J］. Arch pathol Lab Med, 2002;126(6):702-705.

　　［6］  Torhorst J, bucher C, Kononen J, et al. Tissue microarray for rapid linking of molecular changs to clinical endpoints ［J］. Am  J  Pathol, 2001;159(6):2249-2256.