改良协调性金黄地鼠到大鼠的异位腹腔异种心脏移植模型的建立

            作者：张晓刚，吕毅，王博，李晖，于良，刘昌，仵正，孟珂伟 

【关键词】  ,异种心脏移植

    Establishment of hamstertorat cardiac concordant xenotransplantation model

　　【Abstract】 AIM: To establish a simplified method of heterotopic abdominal cardiac xenotransplantation. METHODS:  The hamster to rat cardiac xenotransplantation was performed by means of "sleeve and cuff" method. The donors common carotid artery was anastomosed to the recipients left renal artery with a "sleeve" anastomosis, and the "cuffed" right pulmonary artery was anastomosed to the left renal vein. The viability of the donors heart was examined by daily palpation of the left abdominal wall. RESULTS:  Of the 105 cases receiving heterotopic abdominal cardiac xenotransplantation, complete success was achieved in 95 cases. The xenograft survived for 3 to 4 d after the transplantation and typical acute vascular rejection was presented. CONCLUSION:  A useful, easy and stable model has been established for the investigation of the mechanism of the concordant xenotransplantation.

　　【Keywords】 cardiac xenotransplantation; heterotopic transplantation;  animal model

　　【摘要】 目的：建立一种改良的异位腹部异种心脏移植模型，解决模型建立中的技术问题. 方法：利用袖套法和cuff套管法完成从金黄地鼠到大鼠的异种心脏移植模型. 将供心的颈总动脉与受者左肾动脉进行袖套式吻合，将供心右肺动脉与受者左肾静脉利用套管法吻合. 每日通过对受体进行左侧腹壁触诊完成对供心功能的评价. 结果：共实施105例异位腹部异种心脏移植模型，95例成功. 异种移植物生存期为移植后3~4 d，并且发生经典急性血管性排斥反应. 结论：建立了一种简便、实用、稳定的用于研究协调性异种移植免疫排斥反应发生机制的动物模型.

　　【关键词】 异种心脏移植; 异位移植; 动物模型

　　0引言

　　随着显微外科技术的不断，一系列多血管脏器的移植，已在啮齿类动物建立成功［1-3］. 异位心脏移植［4］通过将供心的胸主动脉和肺动脉与受者的任何相匹配的动脉和静脉吻合来提供给供心足够的冠状循环系统，以保持供心活力以及去神经心肌的收缩力. 为了研究观察协调性异种移植（concordant  xenotransplantation即不产生超急性排斥的异种移植，一般移植供受体间进化关系较近）的排斥机制、病改变，我们设计出一种改良、简便的金黄地鼠到大鼠异位腹腔异种心脏移植模型.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　供体为雄性金黄地鼠，体质量80~100 g；受体为雄性SD大鼠，体质量180～200 g. 实验动物均由西安大学实验动物中心提供，均正常喂养. 手术显微镜为上海医疗仪器厂生产；Cuff管为聚乙烯材料，口径3 mm. 7/0，9/0双针无损伤缝线,购自上海医用缝合线厂.

　　1.2方法

　1.2.1供体手术金黄地鼠采用氯胺酮（50 mg/kg）麻醉成功后，将动物仰卧位固定于手术板上，常规消毒铺巾. 取腹部正中切口，开腹后将肠袢推向左侧，打开后腹膜，经由下腔静脉注射2~3 mL肝素（0.1 MU/L）生理盐水，待全身肝素化后，自肋缘下横切口剪开膈肌，沿双侧腋前线自肋缘至胸骨剪开胸腔，并将前胸壁向头侧翻转. 于胸主动脉根部切断主动脉及下腔静脉，并游离主动脉周围组织，将心脏、肺脏以及胸腺组织联合切取. 将供心放置于0~4℃无菌复方氯化钠溶液，几秒钟后供心停博，松弛，颜色变白. 以血管钳固定主支气管，作为参照标志物. 剪开心包分离出升主动脉及肺动脉，钝性分离并切除胸腺组织. 游离并结扎左肺动脉，尽可能游离保留右肺动脉，长度约6~8 mm，作为流出道. 将胸主动脉干上左颈总动脉分支修剪保留至约3 mm，做为流入道，并将胸主动脉远端结扎. 提起心脏，用1号线将上、下腔静脉和所有肺静脉一次集束结扎，并在其远端切断. 制作直径为3 mm的Cuff套管，将右肺动脉穿过套管，并将动脉近端翻转包绕Cuff套管，以7/0丝线结扎固定.

　　1.2.2受体手术SD大鼠采用氯胺酮（50 mg/kg）麻醉成功后，将动物仰卧位固定于手术板上，常规消毒铺巾. 取左腹部T形切口，以拉钩撑开腹壁，将胃及肠袢推向右侧，充分暴露手术野. 游离左肾周围脂肪结缔组织，结扎并切断左侧输尿管，游离左肾动、静脉，于左肾动脉靠近腹主动脉处以及左肾静脉靠近下腔静脉处各安置一只血管夹，靠近肾门处切断左肾动脉，以肝素生理盐水冲洗肾动脉游离端. 以7/0无损伤缝线在左肾静脉后壁靠近肾门处缝合两条牵引线，在远端切断左肾静脉，并行左肾切除术. 以9/0无损伤缝线将供心左颈总动脉与受体左肾动脉以袖套法吻合. 将供心右肺动脉Cuff套管插入受体左肾静脉并结扎. 手术过程中心脏表面放置小纱布,纱布表面放置冰屑以保护心肌. 检查肾静脉及Cuff套管无扭转后，依次开放左肾动脉、左肾静脉. 供心迅速充盈恢复血供，颜色红润，并开始心室纤颤，再灌注后1 min，供心开始节律性收缩. 待心肌博动有力,功能良好后，分两层关闭腹腔.

　　术中出血少于3 mL不用特殊处理. 出血稍多者,可以皮下注入3～5 mL生理盐水. 术后2×104 u庆大霉素腹腔注射，正常喂食. 每日触诊受体左侧腹壁, 正常存活时心博有力,心率150～200次/min. 排斥反应时心跳逐渐变弱,节律变慢,心脏体积开始增大、变硬直至停跳. 从供心再灌注后复跳到供心停搏这段时间为移植心存活时间. 观察排斥反应的病理标本以40 g/L甲醛固定，HE染色. 供心在再灌注后3 d内停搏为手术失败.

　　统计学处理： 计量资料用x±s表示，计数资料用率和构成比描述.

　　2结果

　　共实施金黄地鼠至大鼠异位腹部异种心脏移植模型105例. 成功95例，成功率90.5%.失败10例, 其中动脉血栓形成6例,流出道梗阻3例,Cuff套管脱落1例. 手术时间：供心切取（3.18±0.97） min，供心修整（19.3±2.73） min，受体手术（25.9±4.23） min，供心冷缺血时间（44.6±3.63） min. 移植心在移植术后3~4 d发生排斥反应，移植心脏水肿、颜色灰暗发紫，质地变硬，但受体仍存活. 心肌组织可见经典急性血管性排斥反应发生：广泛血管内血栓形成，心肌大面积出血、坏死以及大量单核细胞浸润.

　　3讨论

　　器官移植已逐渐成为终末期器官衰竭的有效手段. 但是，随之而来的世界范围内的供体器官短缺严重阻碍了器官移植的. 异种器官移植则有可能成功解决这一难题［5］. 但是免疫排斥反应的发生仍然是异种移植的临床应用所面临的最大障碍［6］. 因此，我们有必要了解异种移植的免疫排斥反应的发生机制.

　　异位异种心脏移植是一种简便、有效的观察异种排斥反应发生机制的动物模型［7］. Kadner指出,异位移植在实际研究应用中的许多方面要优于原位移植，包括操作简单、容易取得组织活检以及便于观察存活时间等［8］. 1964年Abbott等设计了一种大鼠腹腔异位心脏移植模型,其循环途径为将供心主动脉、肺动脉与受体肾血管水平以下的腹主动脉、下腔静脉吻合. 因受体大血管被横断,下肢及盆腔器官血供及功能受损较大,并发症多,死亡率高. 1969年，Ono等人对于模型建立中的许多手术技巧加以改进，首次应用了端侧吻合技术，以避免完全阻断腹部血管，这种技术被全世界广泛应用. 此后，相继出现许多改良技术［9,10］. 但是，这种模型的建立要求术者有娴熟的显微外科技术，因此，对于初学者难度较大，不易掌握. 1971年Heron介绍一种不用缝合血管的Cuff技术,把心脏移植于受体颈部的皮下尽可能缩短热缺血时间得以成功推广. 但与腹部心脏相比因位于皮下易受外力损伤等,尤其对需要长期存活观察的动物不宜. 我们在Baxter等的同种心脏移植模型的基础上，改良了一种简便、实用的异位腹部大鼠异种心脏移植模型. 这种技术很容易被初学者所掌握，它不需要特殊的显微外科技术，对于静脉行Cuff套管连接，提高了血管通畅率，而且手术时间被大大缩短，手术成功率也明显提高. 改良术式后的供心循环途径为:受体腹主动脉→受体肾动脉→供心左颈总动脉→供心主动脉→冠状动脉→心肌→冠状静脉→右心房→右心室→肺动脉→受体肾静脉→受体下腔静脉. 左心不参与循环,无射血功能,可以看作是一块会搏动的异位组织,或者是一个处于半休息状态的无负荷异位心, 该模型仅维持供心冠脉的血液循环,专供实验研究. 我们应注意：①要选择右肺动脉作为流出道; ②在供心修整时，要将左颈总动脉修剪至2~3 mm，以避免将来受体左肾动脉血栓形成. 而受体的左肾动脉插入供心左颈总动脉的长度应为0.1 mm，以避免血栓形成或袖套滑脱导致出血; ③在开放受体的血管夹后，动脉吻合口处会有少量出血，可自行缓解，不要压迫吻合口处以免血栓形成.

　　总之,此种金黄地鼠至大鼠异位腹部心脏移植模型简单、安全、实用,为研究协调性异种移植排斥反应以及病变化提供了良好的实验模型平台.

　　【】

　　［1］ Fuller TF, Freise CE, Serkova N, et al. Sirolimus delays recovery of rat kidney transplants after ischemiareperfusion injury ［J］. Transplantation, 2003;76(11):1594-1599.

　　［2］ Lee CY, Jain S, Duncan HM, et al. Survival transplantation of preserved nonheartbeating donor rat livers: Preservation by hypothermic machine perfusion ［J］. Transplantation, 2003; 76(10): 1432-1436.

　　［3］ Doenst T, Schlensak C, Kobba JL, et al. A technique of heterotopic, infrarenal heart transplantation with double anastomosis in mice［J］. J Heart Lung Transplant, 2001; 20(7): 762-765.

　　［4］ Tomita Y, Zhang QW, Uchida T, et al. A technique of cervical aorta graft transplantation in mice ［J］. J Heart Lung Transplant, 2001; 20(6): 699-702.

　　［5］ Hammer C. Xenotransplantationwill it bring the solution to organ shortage?［J］. Ann Transplant, 2004;9(1):7-10.

　　［6］ Roos A, Daha MR. Antibodymediated activation of the classical complement pathway in xenograft rejection［J］. Transpl Immunol, 2002;9(24):257-270.

　　［7］ Akpinar E, Bilgin N. A simple technical modification for abdominal cardiac transplantation in rats［J］. Transplant Proc, 1998; 30(3): 807-808.

　　［8］ Kadner A, Chen RH, Adams DH. Heterotopic heart transplantation: Experimental development and clinical experience［J］. Eur J Cardiothorac Surg, 2000;17(4): 474-481.

　　［9］ Demirsoy E, Arbatli H, Korkut AK, et al. A new technique for abdominal heart transplantation in rats［J］. J Cardiovasc Surg, 2003; 44(6): 747-750.

　　［10］ Wang Q, Liu Y, Li XK. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice［J］. Microsurgery, 2005; 25(1):76-79.