鼻咽癌组织DNA聚合酶β基因突变与EBV感染相关

               作者：郑红，李明善, 赵国强，董子明，宋宝义

【关键词】  鼻咽肿瘤

    DNA polymerase β gene mutation in human nasopharyngeal cancer and its relationship with EBV infection

　　【Abstract】 AIM: To study DNA polymerase β (polβ) gene mutation in human nasopharyngeal cancer and its relationship with EBV. METHODS:  Twentysix cases of nasopharyngeal carcinoma tissues and corresponding normal epithelial tissues were collected to study DNA polβ gene mutation with PTPCR, PCRSSCP and DNA sequence analyzing techniques. DNA was extracted and amplified with EBV primers and the results were observed and analyzed. RESULTS:  polβ gene mutation was detected by SSCP in 8 of the 26 nasopharyngeal cancer tissues (with mutation rate 30.8%) and there was no mutation in juxtacancerous tissues. Many types of mutation were found by DNA sequencing. EBVDNA positive rate was 92.3%. The results of experiment indicated that the cases of polβSSCP abnormal were accompanied with EBV infection.  CONCLUSION:  There is polβ alternation in human nasopharyngeal carcinoma, which leads to the sequence alternation in amino acid and spatial structure change. These mutations and EBV infection may play an important role in tumor genesis.

　　【Keywords】 DNA polymerase β; nasopharyngeal neoplasms; gene mutation; EBV

　　【摘要】 目的:  研究探讨鼻咽癌中DNA聚合酶β(DNA polymerase β, polβ)的变异情况及与EBV感染有无相关关系. 方法: 采用RTPCR法（逆转录DNA聚合酶链反应）、PCRSSCP（聚合酶链单链构象多态性分析）、DNA序列分析法对26例鼻咽癌组织及癌旁组织标本进行polβ基因突变研究. 用特异性EBV引物PCR扩增法检测EB病毒，分析出现EBVPCR阳性与polβ突变及鼻咽癌发生之间的相关性. 结果:  polβSSCP结果显示癌旁组织标本中polβ无突变；26例鼻咽癌组织标本中存在polβ基因变异的有8例，突变率为30.8%. polβ基因变异的鼻咽癌标本测序结果显示：核苷酸序列有多种形式的改变. 提取DNA用EBV引物进行扩增，26例鼻咽癌标本中出现阳性的有24例，阳性率为92.3%. 结论: 首次发现在鼻咽癌中存在多种形式的polβ突变，有polβ突变的病例均有EBV感染.

　　【关键词】 DNA聚合酶β；鼻咽肿瘤；基因,突变；EB病毒

　　0引言

　　DNA聚合酶β（DNA polymerase β, polβ）是一种修复酶，在哺乳动物细胞中参与DNA的合成和修复的某些过程［1,2］. 其缺陷与一些肿瘤的发生有关，在人类多种肿瘤中存在polβ突变［3,4］  . 然而有关鼻咽癌中有无polβ基因突变尚少见报道. 我们采集鼻咽癌(nasopharynx cancer, NPC)及癌旁组织(juxtacancerous tissue,JCT)标本，进行polβ基因突变调查，检测EBV感染，并分析与polβ突变间的关系如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　鼻咽癌标本26例（NPCaz）病理证实为鳞状上皮细胞癌，每份标本取癌组织和癌旁正常组织各1块，标本离体后迅速置于液氮中保存. GenBank的M13740序列设计出7对SSCP引物，1对完整的全基因序列引物. 参考GenBank的M20820的EBV病毒序列设计出1对EBVPCR检测引物［5］.

　　1.2方法

　　按照RNA提取试剂盒步骤进行提取总RNA；逆转录合成cDNA，进行七区段扩增；取PCR扩增产物与变性载样缓冲液混匀，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳. 取下凝胶，银染后照相记录并分析SSCP结果； PCR产物与pGEMT载体连接，转化入JM109细胞中进行PCR产物的克隆； 用碱裂解法提取质粒DNA，利用荧光标记法ABI 377测序仪双向测定DNA序列（由上海生工公司完成）. 所得结果利用DNASIS软件与GenBank中查到的DNA polβ基因进行同源比较和分析. 按照Qiagen公司DNA提取试剂盒说明提取组织的DNA；以去离子水为阴性对照，以EBV为阳性对照进行EBVDNA的PCR扩增；取PCR扩增产物溴酚蓝加样缓冲液充分混合后，于20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下观察扩增结果.

　　2结果

　　在26例鼻咽癌组织中有8例SSCP异常，突变率为30.8%(Fig 1). 而对应的26例癌旁组织中未见异常；鼻咽癌组织polβ突变位点见Tab 1；DNASIS软件Choufasman算法推测polβ肽段二级结构；在26例鼻咽癌及对应癌旁组织中共检出，EBVDNA阳性的24例（癌及对应癌旁组织一致），EBVDNA的阳性率为92.3% (Fig 2).表1鼻咽癌组织中polβ突变位点及类型（略）

　　3讨论

　　polβ是一重要的DNA修复酶，该酶基因的突变与肿瘤的发生密切［6］. 由于PCRSSCP技术的引入，使得从大量标本中准确、灵敏地筛选出DNA polβ基因突变成为可能,对DNA  polβ基因突变的研究更为深入. 我们对非高发区鼻咽癌（均为鳞癌）的研究,首次发现polβ基因的突变，突变率为30.8%，其突变点与报道的其他类型肿瘤中polβ突变有所不同. 核苷酸排列顺序的改变，导致氨基酸的改变，可能致使错配修复系统损伤，致原癌基因和肿瘤抑制基因突变, 最终导致肿瘤的发生. EBV在鼻咽癌发生中的作用, 近年来随分子生物学技术的提高而深入［7,8］. 我们用EBV引物对非高发区鼻咽癌进行DNA检测，阳性率为92%，与报道一致, 进一步明确了EBV与鼻咽癌的关系. 同时发现出现polβ PCRSSCP阳性的病例均有EBV感染, 而EBV感染不是都有polβ的突变. EBV感染和polβ基因突变可能起协同作用，在鼻咽癌发生中起重要作用.

　　【文献】

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