当归酰天芥菜定对 L1210，HepG2和HCC细胞的抑制作用

【关键词】  当归酰天芥菜定

　　Inhibitory effects of angeloylheliotridine on L1210, HepG2 and HCC cells

　　【Abstract】 AIM:  To study the antitumor activity and its mechanism of angeloylheliotridine (AH). METHODS: The inhibitory effects of AH on L1210 cells were analyzed by drawing up their diagram of growing curves. Growth inhibition of L1210, HepG2 and HCC cells was measured by microculture tetrazolium (MTT) assay. The cell cycle of L1210 cells was tested by flow cytometry (FCM). RESULTS:  The slopes of growing curves and the maximums of growing density of L1210 cells exposed to AH decreased. When exposed to AH 80 mg・L-1, the inhibitory rate of L1210 cells was 18.18% and exposed to AH 320 mg・L-1, the inhibitory rates of HepG2 and HCC cells were 12.28% and 10.24% respectively. FCM indicated that L1210 cells in G2M phase increased significantly (P<0.01) following 24hour exposure to AH 80 mg・L-1. CONCLUSION:  AH exerts some inhibitory effects on L1210 cells and blocks L1210 cells in G2M phase of cell cycle. AH has relatively weak inhibitory effects on HepG2 and HCC cells.

　　【Keywords】 angeloylheliotridine; L1210 cells; HepG2 cells; HCC cells; MTT assay; FCM; cell cycle

　　【摘要】  目的: 研究当归酰天芥菜定（AH）的抗肿瘤活性及机制. 方法： 通过细胞生长曲线的绘制，分析AH对L1210细胞的抑制作用；通过MTT比色法，测定AH对L1210，HepG2和HCC细胞的抑制率；通过流式细胞术（FCM）检测AH对L1210细胞周期的影响. 结果： 在AH作用下，L1210细胞生长曲线斜率和最大生长密度降低. AH 80 mg・L-1对L1210细胞的抑制率为18.18%；AH 320 mg・L-1对HepG2和HCC细胞抑制率分别为12.28%和10.24%. FCM检测表明，AH 80 mg・L-1作用24 h后，L1210细胞的G2M期细胞明显增加（P<0.01）. 结论： AH对L1210细胞有一定的抑制作用，对HepG2和HCC细胞抑制作用较差. AH对L1210细胞的抑制作用发生在细胞周期的G2M期.

　　【关键词】 当归酰天芥菜定；L1210细胞；HepG2细胞；HCC细胞；MTT法；流式细胞术；细胞周期

　　0引言

　　菊科狗舌草属植物狗舌草（Tephroseris kirilowii Turcz. Holub.）在民间被用于白血病［1］. 陈进军［2］研究发现，狗舌草600 mL・L-1乙醇提取物对L1210细胞有抑制作用，并推断该作用可能来自狗舌草中含有的生物碱等成分. 为了进一步弄清狗舌草的有效成分，我们对狗舌草的生物碱成分进行了分离和鉴定（其结果即将刊登于西北农林科技大学学报），并研究了狗舌草中主要生物碱当归酰天芥菜定（Angeloylheliotridine, AH）对白血病L1210及肝癌HepG2和HCC细胞的作用，现报告如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料植物材料狗舌草于199908采自陕西省陇县关山牧场，经西北农林科技大学生命学院植物研究所高级实验师杨金祥予以鉴定. 经过溶剂萃取、硅胶柱层析和制备性薄层层析从狗舌草中分离得到AH；薄层层析（TLC）和气相色谱质谱联用（GCMS）检测，AH为纯净的单体化合物；质谱（MS）、红外光谱（IR）及核磁共振碳谱（13C NMR）对AH的结构进行了确认(Fig 1). L1210，HepG2和HCC细胞由第四军医大学实验动物中心提供. 酶联免疫检测仪，DG5031型，国营华东管厂；流式细胞仪，Epics ELITE ESP型，Coulter公司. MTT和DMSO，Sigma产品；RPMI 1640培养基，Gibco产品；其余试剂为国产分析纯.

　　图1当归酰天芥菜定（AH）的结构　(略)

　　1.2方法

　　1.2.1生长曲线绘制取对数生长期的L1210细胞调密度至6×106・L-1，接种于培养瓶内，50 mL・L-1 CO2, 37℃培养. 24 h后加入用生理盐水稀释的AH，使其终浓度分别为40, 80, 160和320 mg・L-1，另设一个生理盐水对照组. 重复1次. 从加药之日起连续记数7 d，绘制出生长曲线.

　　1.2.2MTT法测抑制率将L1210细胞调密度至1×106・L-1，96孔培养板每孔加入细胞120 μL ；HepG2细胞调密度至5×108・L-1，每孔加入200 μL；HCC细胞调密度至5×107・L-1，每孔加入200 μL. 培养24 h后，加入AH，使其终浓度分别为80, 160和320 mg・L-1，每种细胞、每个浓度平行处理3孔，另设生理盐水对照组及只加培养液不加细胞的调零孔. 培养2 d后，加入5 g・L-1 MTT，每孔20 μL，再培养4 h后，小心抽出培养液，加入200 μL DMSO，振荡，10 min后，490 nm酶联免疫仪比色，经调零孔调零，测吸光度（A）值. 抑制率（%）=［（对照组A值-实验组A值）/对照组A值］×100%.

　　1.2.3流式细胞术（FCM）检测细胞周期取对数生长期的L1210细胞5×105个，用培养液配为9 mL，培养24 h后，加入1 mL AH，AH终浓度为80 mg・L-1，继续培养. 24 h后，将细胞离心，PBS洗涤2次，700 mL・L-1冷乙醇固定，4℃冰箱过夜. 送检前用PBS洗2次，DNA prep kit 染色20 min，流式细胞仪检测. 每个样品计数2×105个细胞，经Phoenix Multicycle 3.11软件处理.

　　统计学处理: 以上各方法所得数据，在判断试验组和对照组差异是否显著时，采用t检验进行处理.

　　2结果

　　AH各浓度组的生长曲线均在生理盐水组右下方，斜率和最大生长密度降低，显示了AH对L1210细胞的抑制作用(Fig 2). 利用MTT法测得生理盐水对照组及AH各浓度组的A值和抑制率（Tab 1），对L1210细胞，AH 80, 160及320 mg・L-1与生理盐水对照组的A值差异极显著（P<0.01），其抑制率分别为18.18%, 26.02%和18.18%；对HepG2及HCC细胞，AH 80 mg・L-1和160 mg・L-1与对照组无显著差异，320 mg・L-1与对照组差异极显著（P<0.01），该浓度对HepG2和HCC细胞抑制率分别为12.28%和10.24%. AH 80 mg・L-1作用24 h后，L1210细胞与对照组相比，G2M期细胞增多（P<0.01），出现G2M周期阻滞（Fig 3, 4）.

　　图2加入AH后L1210细胞生长曲线　(略)

　　表1AH对肿瘤细胞的抑制率　(略)

　　图3对照组L1210细胞的细胞周期　(略)

　　3讨论

　　从以上结果可看出，AH对L1210细胞有一定的抑制作用，80 mg・L-1浓度可产生作用. AH对HepG2和HCC细胞抑制作用较差，只在浓度320 mg・L-1

　　图4AH 80 mg・L-1组L1210细胞的细胞周期　(略)

　　时才有作用. 实验证实了AH是狗舌草抗白血病细胞的有效成分之一.

　　在细胞生长周期中，存在着两个调节细胞周期正常进行的关键点，即G1S和G2M期，肿瘤细胞抑制剂通常在这两个时期对肿瘤细胞发挥抑制作用，如杀尔威辛（Salvicine）对K562细胞［3］、Cyclin D1反义核酸对A375细胞［4］、木黄酮（Genistein）对人垂体腺瘤细胞［5］及全反式维甲酸（Alltrans retinoic acid）对SMMC7721细胞［6］和QBC939细胞［7］的抑制作用发生在G1S期，而姜黄素(Curcumin)可将SMMC7721细胞和人口腔鳞癌细胞阻断在S/G2M期［8］，逆转录酶抑制剂（AZT）阻断HO8910细胞于G2M期 ［9］. 本研究发现，AH对L1210细胞生长周期的阻滞发生在G2M期，这可能是其抑制L1210细胞生长的作用机制.从结构上讲，AH属于双稠吡咯啶生物碱（Pyrrolizidine alkaloids, PAs），部分PAs具有抗肿瘤活性和肝脏毒性. 当PAs具有大环双酯结构和烯丙醇酯结构时，毒性较大，而AH不具有这样的结构，预计其毒性较小，确切情况尚须研究证实.

　　【】

　　［1］ The National Writing Group of Chinese Herbal Medicine Compilation. National Chinese herbal medicine compilation ［M］. Beijing: Renmin Weisheng Chubanshe (People’s Medical Publishing House), 1973:557.

　　［2］ Chen JJ. Studies on pharmacological effects and toxicity of extraction from Tephroseris kirilowii Turcz. Holub. against L1210 cell line ［D］. Xi’an:  Northwest SciTech University of Agriculture and Forestry, 2001.

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　　［4］ Wang XL, Tian ML, Wang M, Zhu HM, Yang XJ, Wang YL, Song TB. Antisense oligonucleotide inhibits the growth of human melanoma cells and influences its cycle ［J］. J Xi’an Jiaotong Univ (Med Sci), 2002;23(4):342-343.

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　　［7］ Wu T, Dou KF, Li KZ. Alltrnas retinoic acidinduced apoptosis in human cholangiocarcinoma cell line ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2002;23(14):1284-1286.

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