非何杰金淋巴瘤微血管密度及其血清bFGF水平

【关键词】  碱性成纤维细胞生长因子

　　Tissue microvessel density and levels of serum basic fibroblast growth factor in patients with nonHodgkin’s lymphoma

　　【Abstract】 AIM:  To explore the levels of serum basic fibroblast growth factor (bFGF) and the tissue microvessel density (MVD) in nonHodgkin’s lymphoma (NHL) patients with different clinical and pathological features. METHODS:  In 32 NHL patients (13 newly diagnosed and 19 in remission after chemotherapy) and 10 healthy controls, ELISA was used to detect their serum level of bFGF and FⅧ RAG was used as the marker of endothelial cells to detect MVD in 20 cases of the 32 NHL patients and 10 cases of benign lymphadenopathy. The statistic t test was used to analyze the difference among different groups. RESULTS:  The mean concentrations of serum bFGF in the untreated patients and patients in remission after chemotherapy were（7.6±1.2) ng・L-1 and （4.1±1.0）ng・L-1, respectively, which were higher than that ［（1.7±1.4）pg・L-1］ in healthy controls (P<0.05). The serum bFGF level in Tcell type NHL was significantly higher than that in Bcell type ［(10.7±1.4) ng・L-1 vs （2.7±1.0）ng・L-1, P<0.05］. The mean MVD of the 20 NHL cases (39±18) was obviously higher than that in benign lymphadenopathy group (13±5, P<0.05) and the mean MVD in Tcell type NHL was significantly higher than that in Bcell type（47±15 vs 27±17, P<0.05）. CONCLUSION:  The NHL patients, especially those with Tcell type NHL, have significantly higher serum bFGF levels and tissue MVD than controls. The data presented here strongly suggest that the bFGFmediated angiogenesis may closely be correlated with the pathogenesis and pathologic characteristics in NHL.

　　【Keywords】 basic fibroblast growth factor; nonHodgkin’s lymphoma; ELISA; microvessel density; immunohistochemistry

　　【摘要】 目的:  分析不同临床特征和病理分型的非何杰金淋巴瘤(NHL)患者的血清碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)水平及瘤性组织微血管密度（MVD）的差异. 方法: 收集32（初发未经化疗13，化疗后缓解19）例NHL患者及10例健康对照者血清，采用夹心ELISA法测定其bFGF水平；采用vWF抗体组化染色法检测其中20（T细胞型8，B细胞12）例NHL组织的MVD，以10例良性淋巴结病组织作为对照. 统计学分析，采用t检验法. 结果: 13例初发患者（7.6±1.2）ng・L-1、19例化疗后缓解患者(4.1±1.0) ng・L-1的bFGF水平均显著高于健康对照 (1.7±1.4) pg・L-1，P<0.05；初治患者与缓解患者间bFGF水平无统计学意义，但T细胞型（10.7±1.4）ng・L-1显著高于B细胞型［（2.7±1.0）ng・L-1, P<0.05］. 20例NHL及10例良性淋巴结病组织平均MVD分别为(39±18)和(13±5)，相差显著（P<0.05）；T细胞型患者平均MVD明显高于B细胞型（47±15 vs 27±17, P<0.05）. 结论: NHL，尤其是T细胞型患者，其血清bFGF水平及组织MVD均值显著增高. 提示bFGF介导的血管新生可能与NHL的发生及病理特征密切相关.

　　【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子；非霍奇金淋巴瘤；酶联免疫吸附试验；微血管密度；免疫组化

　　0引言

　　在肿瘤形成过程中，异常的血管生成发挥着关键作用［1］. 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一种十分重要的正性调控因子. 已发现，在多种癌症患者的体液中，bFGF水平明显高于正常人［2］. 最近，Salven等［3］研究指出，初发非何杰金淋巴瘤(NHL)患者血清中高浓度的bFGF可用于预后判断，提示bFGF可能是该病一种新的病情指标，值得进一步探讨. 据此，我们测定了32例NHL患者血清bFGF水平；并检测了部分NHL组织的微血管密度（microvessel density，MVD），以进一步证实血清bFGF水平和MVD与NHL恶性生物学特征间的关系.

　　1对象和方法

　　1.1对象西京血液内科200101/200212间NHL患者32（男17，女15）例，年龄30~82（平均54）岁，均经组织病理确诊. 按病理形态学及免疫组化结果分为T细胞型（9例）和B细胞型(19例),另4例不能分类；按原发灶不同部位分为结性（淋巴结、脾脏及扁桃腺，20例）及结外（鼻窦鼻腔、胃体、回盲部、肾上腺，12例）两大类. 采用Ann Arbor法进行临床分期，其中I期5例，II期13例，III期2例，IV期12例. 化疗前采血者13例，化疗后缓解期采血者19例，化疗方案分别为CHOPBleo（环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松、博莱霉素）和MBACOD（米托蒽醌、博莱霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松）. 至2003/02所有患者均存活，并在继续观察中. bFGF对照血清取自10例健康志愿者；MVD检测对照为10例良性淋巴结病组织. 20（T细胞型8，B细胞型12）例NHL石蜡包埋组织来自第四军医大学病教研室.

　　1.2方法

　　1.2.1血清收集及bFGF检测采集患者及健康对照者静脉血3～5 mL，室温静置1 h,待凝固、血清析出后，2000 g离心10 min, 分离血清，-80℃冻存备检. bFGF检测采用ELISA法（夹心ELISA检测试剂盒系美国R＆D System公司产品）. 将样本和标准品各100 μL加入已包被bFGF mAb的96孔板，室温孵育2 h，洗板后加入辣根过氧化物酶标记的bFGF多抗，室温孵育2 h，再次洗板后加入底物，避光显色30 min后加入终止液，酶标仪上测各孔A450 nm值. 所有样本均作复孔. 依据标准品bFGF浓度及A450 nm值绘制bFGF质量浓度-A450 nm标准曲线，依据标准曲线求出每样本各孔bFGF质量浓度，以每样本两孔bFGF浓度平均值作为该样本血清bFGF值.

　　1.2.2微血管密度检测采用免疫组化DaKo EnVision二步法①切片常规脱蜡至水；②微波修复10 min，PBS振洗3×5 min；③30 mL・L-1过氧化氢甲醇溶液阻断10 min后，PBS振洗3×5 min；④200 mL・L-1羊血清封闭，37℃湿盒内孵育60 min，倾去血清，滴加一抗（兔抗人Ⅷ因子相关抗原  FⅧRAG  DAKO公司），4℃过夜，次日复温至37℃；⑤PBS振洗3×5 min后，加DaKo EnVisionTM+/HRP显色系统（DAKO公司），37℃孵育60 min；⑥PBS振洗3×5 min后，DAB显色，水洗终止；⑦苏木素复染细胞核1 min；⑧脱水透明，中性树胶封片. 结果判定：FⅧRAG（兔抗人Ⅷ因子相关抗原，DAKO公司）以血管内皮细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准；MVD计数参照Weidner等［4］报道的方法，在低倍视野下选取肿瘤微血管数量（FⅧRAG阳性）最丰富区域，在200×视野范围5个视野的微血管数目，取平均值作为MVD.

　　统计学处理: 组间比较应用t检验和非参数秩和检验.

　　2结果

　　2.1NHL患者血清bFGF水平32例NHL患者血清bFGF平均浓度为（7.7±1.27）ng・L-1，较正常对照组（1.7±1.4） pg・L-1明显升高（P0.05），虽然缓解期患者血清bFGF较初发未治者有所下降，但无统计学意义. 在不同临床分期与不同发病部位间血清bFGF水平无明显差别，但T细胞型NHL的bFGF明显高于B细胞型. 男女性别及小于和大于60岁的患者血清bFGF无明显差别（Tab 1）.

　　表1非何杰金淋巴瘤血清bFGF水平　(略)

　　2.2NHL组织MVD20例NHL组织MVD值(39±18)明显高于对照组（13±5）（Fig 1，2），其中T细胞型MVD均值（47±15）明显高于B细胞型(27±17) (P0.05)，表明T细胞型NHL组织有更为丰富的微血管形成.图1NHL患者组织MVD

　　图2良性淋巴结病组织MVD　(略)

　　3讨论

　　恶性血液病如同实体瘤也存在异常血管生成现象. 国外研究发现白血病患者的骨髓较健康对照骨髓有明显增高的微血管密度，推测白血病细胞诱导了异常的骨髓血管生成，这种异常血管生成又是白血病发生的依赖条件之一，二者互为促进［5］. Vacca等［6］发现在NHL组织中，高度恶性组较低度恶性组微血管密度高，提示血管生成与NHL发生及恶性程度可能有一定关系.

　　本研究中，多数NHL患者，包括初发及化疗后持续缓解者，血清bFGF水平均较正常人有显著增高,且瘤组织中MVD显著高于对照,这一结果基本支持Vacca的观点. 提示NHL的发生可能与bFGF诱发的血管生成有一定相关性，但血清bFGF水平与NHL原发部位、年龄及临床分期并无直接关系. 尽管如此，我们发现NHL患者血清bFGF水平在T细胞型与B细胞型之间却存在明显差异，T细胞型MVD均值也明显高于B细胞型. 鉴于临床上T细胞谱系淋巴瘤往往具有耐药、易复发等高恶性特征，故这一异常的bFGF和MVD是否直接或间接影响了T细胞型NHL的恶性生物学过程，值得进一步研究. 至于NHL血清中高水平的bFGF究竟是源自瘤细胞的自分泌还是机体对瘤细胞反应，目前尚无定论. 因为体内分泌bFGF的细胞较多如外周血白细胞 ［7］，血管内皮细胞等［8］. 为试图说明瘤体血清中bFGF升高的机制，Kandel等［9］建立了一种鼠纤维肉瘤模型，结果发现bFGF的表达在肿瘤初期处于正常状态，至后期鼠血清bFGF则显著升高，这种变化与瘤体内相应的血管新生同步. 这一多阶段肿瘤血管生成模式虽提示血清bFGF与肿瘤组织血管新生密切相关，但仍不能说明bFGF的确切细胞来源. 本结果在一定程度上也基本支持Kandel的观点.

　　bFGF作为一种强有力的促血管生成剂，在许多肿瘤血管生成中是不可缺少的因素，但并非唯一的因素. 目前发现，bFGF与VEGF作用密切相关［10］，实验表明静息期的内皮细胞不表达VEGF，但内皮细胞培养时加入bFGF或上调其内源性bFGF均能引起靶细胞的VEGF表达增加. 动物模型显示，bFGF诱导的VEGF合成及小鼠角膜血管形成，能被VEGF抗体阻断，因此内皮细胞产生的VEGF可能是bFGF诱导血管生成的一种重要的“中介”自分泌因子. 根据以上报道并结合本研究，我们推测，NHL患者血清中高水平的bFGF也可能是通过VEGF的中介作用，间接刺激血管新生，致使NHL组织MVD增高，从而影响NHL细胞的恶性生物学特性. 因此，这一结果有可能为以 bFGF/VEGF及其受体为作用靶点的新的抗NHL策略提供初步依据.

　　【文献】

　　［1］ Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease ［J］. Nat Med, 1995; 1(1):27-31.

　　［2］  Kolomecki K, Stepien H, Narebski JM. Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor evaluation in blood serum of patients with hormonally active and inactive adrenal gland tumours ［J］. Cytobios, 2000;101(396):55-64.

　　［3］ Salven P, Teerenhovi L, Joensuu H. A high pretreatment serum basic fibroblast growth factor concentration is an independent predictor of poor prognosis in nonHodgkin’s lymphoma［J］. Blood, 1999;94(10):3334-3339.

　　［4］ Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma ［J］. N Engl J Med, 1991; 324(1): 1-8.

　　［5］ PerezAtayde AR, Sallan SE, Tedrow U, Connors S, Allred E, Folkman J. Spectrum of tumor angiogenesis in the bone marrow of children with acute lymphoblastic leukemia［J］. AmJ Pathol, 1997;150(3):815-821.

　　［6］ Vacca A, Ribatti D, Ruco L, Giacchetta F, Nico B, Quondamatteo F, Ria R, Iurlaro M, Dammacco F. Angiogenesis extent and macrophage density increase simultaneously with pathological progression in Bcell nonHodgkin’s lymphomas［J］. Br J Cancer, 1999;79(5):965-970.

　　［7］ Vacca A, Ribatti D, Iurlaro M, Albini A, Minischetti M, Bussolino F, Pellegrino A, Ria R, Rusnati M, Presta M, Vincenti V, Persico MG, Dammacco F. Human lymphoblastoid cells produce extracellular matrixdegrading enzymes and induce endothelial cell proliferation, migration, morphogenesis, and angiogenesis［J］. Int J Clin Lab Res, 1998;28((1):55-68.

　　［8］ SchulzeOsthoff K, Risau W, Vollmer E, Sorg C. In situ detection of basic fibroblast growth factor by highly specific antibodies［J］. Am J Pathol, 1990;137(1):85-92.

　　［9］ Kandel J, BossyWetzel E, Radvanyi F, Klagsbrun M, Folkman J, Hanahan D. Neovascularization is associated with a switch to the export of bFGF in the multistep development of fibrosarcoma［J］. Cell, 1991;66(6):1095-1104.

　　［10］ Seghezzi G, Patel S, Ren CJ, Gualandris A, Pintucci G, Robbins ES, Shapiro RL, Galloway AC, Rifkin DB, Mignatti P. Fibroblast growth factor2 (FGF2) induces vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in the endothelial cells of forming capillaries: An autocrine mechanism contributing to