不同浓度BME对大鼠胚胎脊髓神经干细胞增殖和分化的影响

【关键词】  神经干细胞

     Effect of βmercaptoethanol on proliferation and differentiation of neural stem cells from embryonic rats

　　【Abstraet】 AIM:  To explore the effects of different concentrations of βMercaptoethanol (BME) in DFI2 containing 10 mL/L fetal cow serum (FCS) on the proliferation and differentiation of neural stem cells from rat embryonic spinal cord. METHODS:  We isolated neural stem cells (NSCs) from the spinal cord and purified them through 23 generations. We then used different concentrations of BME containing 10 mL/L  FCS to induce NSCs in vitro, observed the cells in three phases, identified the differentiation using immunocytochemistry by GFAP and NSE 24 h later, and analyzed the results. RESULTS:  Proliferation was observed in NSCs induced either by BME (0.5 mmol/L or l mmol/L) and FCS or only by FCS. The differentiation rate of NSCs to neurons induced by BME (0.5 mmol/L) was 49% and 10% by FCS, while the differentiation rate of NSCs induced by BME (l mmol/L) significantly increased to 58%. The differentiation rate of astrocytes induced by BME (0.5 mmol/L or l mmol/L) and FCS or only by FCS was 46%, 35% and 83%. CONCLUSION:  BME has significant effect on inducing NSCs to neurons, but BME also has some cell toxicity. The effect of BME combined with FCS is much better than that of using only BME or FCS.

　　【keywords】  βmercaptoethanol(BME); neural stem cells; cell differantiation

　　【摘要】  目的： 观察含10 ml/L血清的不同浓度的β一巯基乙醇(BME)对大鼠胚胎脊髓神经干细胞增殖和分化的影响. 方法： 从大鼠胚胎脊髓中分离神经干细胞，经过2~3次传代培养后，采用含10 ml/L血清的不同浓度的BME分组对细胞进行体外诱导，选择3个时段观察细胞形态变化情况，诱导24 h后采用GFAP和NSE免疫荧光染色法鉴定分化结果，同时对分化结果进行统计学分析. 结果： 用BME(0.5 mmol/L)组和对照组血清诱导的神经元的百分率分别为49%和10%，而BME(1 mmol/L)组的神经元分化率显著升高至58%. 由BME(0.5 mmol/L)组、BME(1 mmol/L)组和对照组血清诱导的星形胶质细胞分化率分别为46%，35%和83%. 结论： BME有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用. 配合血清使用可使细胞向神经原分化的趋势明显优于单纯使用血清，两者协同效应明显.

　　【关键词】 β一巯基乙醇(BME)；神经干细胞；细胞分化

　　0引言
   
　　β巯基乙醇(βmereaptoethanol, BME)又名2巯基乙醇，是具有硫醇臭味的无色或微黄色透明液体，作为一种化学原料药具有抗氧化作用. Woodbury等［1］证实它在诱导骨髓基质干细胞(marrow stromal cells, MSCs)向神经元方向分化的过程中起到关键作用,陈霞平等［2］对BME诱导MSCs作用也有相关报道. MSCs在被诱导分化为成熟神经细胞的过程中必定经过神经干细胞阶段. 因此，本研究将成功诱导MSCs的BME配合血清作用于神经干细胞，以观察其对神经干细胞增殖过程及分化结果的影响.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　受孕SD大鼠(E10E12)由第四军医大学实验动物中心提供；DMEM/F12, N2添加剂均购自Gibco公司；EGF, bFGF购自Sigma公司，兔抗鼠NSE,GFAP,NESTIN一抗以及羊抗兔FITC, CY3荧光二抗均购自博士德公司；BME，多聚赖氨酸，胰蛋白酶均购自Sigma公司. 倒置相差光学显微镜OLYMPUS  IX70型.

　　1．2方法

　　1．2．1NSC原代培养依照Weiss的实验模型［3,4］，将孕大鼠(E10~E12)脱颈处死后，750 ml/L乙醇浸泡消毒10 min，在无菌条件下打开腹腔，取出胚胎，解剖显微镜下分离胎鼠脊髓，在4℃ DHanks液内用解剖剪将脊髓减碎成l mm×l mm×1 mm，用火焰抛光的吸管将剪碎的组织小块机械吹打成单细胞悬液，800 r/min离心5 min后弃沉渣，血细胞计数板细胞计数，以条件培养基(DMEM/F12为基本培养基，N2添加剂以1∶100稀释，EGF, bFGF［5,6］终浓度为20 μg/L. 调整细胞密度约为9×105个/L后接种于培养瓶内，置于37℃, 50 ml/L CO2孵箱中培养. 每隔2~3 d更换新鲜培养液，5~6 d传代.

　　1．2．2实验分组将盖玻片放入24孔板，并用多聚赖氨酸包备37℃过夜，使用前用PBS冲洗干净. 将传至第3代的神经干细胞克隆球用滴管吹打成单细胞悬液，仅使用基本培养基而不加入EGF，bFGF和N2，并稀释至7.5×106个/L，接种到24孔板，每孔l  mL细胞悬液. 每6孔为一组，共分三个试验组(A~C组)和一个对照组(D组). A~C组分别使BME终浓度达到0.5, 1和2 mmol/L,并分别加入l/100体积浓度的胎牛血清，而D组仅加入1/100体积浓度的胎牛血清.

　　1．2．3免疫细胞化学检测各组细胞于诱导24 h后吸干液体，40 g/L多聚甲醛(10 mmol/L PBS配置)室温固定30 min, 10 mmol/L PBS冲洗3 min×3次. 滴加山羊血清封闭，20 min后吸去余液. 加入一抗NSE(1∶250)和GFAP(1∶250)分别标记分化后的神经原和星形胶质细胞. 放于4℃过夜. 复温PBS冲洗后加入荧光二抗，2 h后甘油封片观察.

　　统计学处理：在每张盖玻片上随机取10个视野观察，分别对每视野中NSE及GFAP染色细胞和所有细胞计数. 采用SPSS10.0进行ChiSquare检验，P<0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2．1NSCs的原代培养相差显微镜观察，原代后的1~2 d里由于培养基的高度选择性和机械吹打损伤使得部分细胞死亡，绝对数量明显减少. 培养3 d后细胞快速生长，逐渐形成由数十个至数百个细胞组成体积大小不等的克隆球(neurosphere)悬浮生长(Fig 1A)，表面凹凸不平，折光性强. 随着培养时间的延长，这些克隆球不断增大，其中有个别神经干细胞生长速度明显快于其余细胞，由这个别细胞形成的新的克隆球会出现在母球表面并逐渐脱离旧的克隆球(Fig 1B). 此时如果停止传代，这些体积较大的克隆球生长减缓，折光性减弱.

　　2．2BME对神经干细胞增殖的作用将BME加入24孔板后，我们选择4, 12和24 h三个时间点借助倒置相差光学显微镜观察神经干细胞形态变化情况. 发现D组纯血清诱导神经干细胞大约在2 h左右即有个别细胞发生形变，4 h时明显增多. A组与对照组纯血清组几无差别，B组神经干细胞同样发生梭型变，个别细胞形似水滴状，推测是分化方向为神经元的过渡细胞(Fig 2)，但也有小部分细胞维持原状或逐渐黯淡，死亡. C组细胞分化很少，大量神经干细胞死亡.

　　2．3BME对神经干细胞的分化作用在纯血清对照组中，NSE和GFAP阳性的比例分别为10%和83%；A组中NSE和GFAP阳性的比例分别为49%和46%；B组中NSE和GFAP阳性的比例分别为58%和35%(Fig 3,4): C组因为大量细胞已经死亡，故未做免疫荧光染色.

　　2．4对得到数据进行统计学分析将每组6孔每孔10个随机视野共60个NSE染色细胞数据分别记录，统计结果各组之间差异明显（P<0.001）.

　　3讨论

　　以往中报道大鼠脊髓神经干细胞培养大都选取胎龄在13~14 d胎鼠为实验材料，但在实际操作中发现孕13~14 d胎鼠脊髓系统已初步发育成形，血管膜紧缚在上，结缔组织出现，不但增加取材难度，且使用胰蛋白酶消化时势必增加消化时间，加大对神经干细胞的损伤［7］. 在分离过程中因为出血明显，原代的培养基中势必会留有少量血清，很容易使原代大量神经干细胞分化贴壁，这对以后实验的客观性分析及试验进程都产生影响. 而孕10~12 d胎鼠脊髓尚未完全成型，还处在中空的神经管阶段. 神经干细胞含量高，活性好，较易分离. 且无需胰蛋白酶消化，小心机械吹打即可形成单细胞悬液，在本实验过程中观察发现原代极少分化.

　　DMEM  F12作为改良型的培养液，与原MEM培养液相比较营养成分加倍，对细胞的分裂增殖十分有利［8］，而且Ham  F12所含微量元素非常适于无血清情况下的细胞培养. 目前进行神经组织的培养，一般以DMEM与F12的1∶1混合培养基为基础培养基. 但现在商品化常见高糖型DMEM培养基含糖量仅为4.5 g/L,难以满足以糖代谢为主要能源的神经细胞. 我们的实验将DMEM  F12基本培养基中的葡萄糖含量添加至6 g/L，与普通高糖DMEM(糖4.5 g/L)相比，细胞生长活力明显增强，克隆球形成更早，形态更规则，原代之后死亡细胞数明显减少.

　　目前已知的大量神经干细胞体外诱导实验中，化学物质以其独特的优势在其中占有相当比例. 与各种生物自身因子诱导最少几日才可见效果相比，化学诱导剂往往在加入数小时内细胞就发生形变，部分诱导剂24 h左右即可完成整个诱导过程，而且结果确切高效. 以最常见的化学诱导剂RA为例,在已知文献报道中，诱导神经干细胞最终分化为神经元的比例可高达90%左右［9］. 但化学诱导剂的细胞毒性较大，长时间使用对细胞损伤较大严重制约了其在临床上的应用. 在我们的试验中曾尝试将诱导剂BME以试验组相同浓度在无血清情况下加入细胞培养液中. 在随后观察中发现4 h左右就有个别细胞发生形变，但随后细胞整体状态明显下降，24 h死亡细胞过半. 在配合血清使用后仍可以发现细胞死亡程度随诱导剂浓度增加而增加. 试验组细胞在成功诱导后如不及时换掉含诱导剂培养基，换成普通培养基，细胞仍有死亡. 所以要利用化学成分对干细胞进行诱导并最终应用于临床治疗首先必须解决细胞毒性从始至终对细胞的伤害. 我们认为BME和血清的联合使用有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用，其结果明显优于单纯使用血清. 不但降低了单一使用化学成分的严重毒性，而且血清也不仅仅依靠本身的诱导作用，其含有的丰富的营养物质和生长因子对BME的诱导具有协同作用，也是一种辅助作用.

　　【文献】

　　［1］ Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons ［J］. J Neurosci Res, 2000;61(4):364.

　　［2］ 陈霞平，阮绪芝，张群林，等. NGF和BME对小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用［J］.医学杂志，2004；14（15）：20-23.

　　Chen XP, Ruan XZ, Zhang QL, et al. Effects of NGF and BME on differentiation of mMSCs into neuronlike cells ［J］. Chin J Mod Med, 2004；14（15）：20-23.

　　［3］ Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cell of adult mammalian central nervous system ［J］. Science, 1992;225:1707-1710.

　［4］ 章翔. 加强神经干细胞的基础与应用研究［J］. 第四军医大学学报，2003；24（22）：2017-2020.

　　Zhang X. Improvement on study of application and base of neural stem cell ［J］. J Fourth Mil Med Univ,  2003；24（22）：2017-2020.

　　［5］ Gfitti A, Parati EA, Cova L, et al. Multipotential stem cells from adult mouse brain proliferate and selfrenew in response to basic fibroblast growth factor ［J］. J Neurosci, 1996；16(3)：1091-1100.

　　［6］ Ciccolini F, Svendsen CN. Fibroblast growth factor 2(FGF2) promotes acquisition of epidermal growth factor(EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cell: Identifieation of neural precursors responding to both EGF and FGF2 ［J］. J Neurosci, 1998；18（19）：7869-7880.

　　［7］ 章翔，林绿标，姬西团，等. 外源性一氧化氮对小鼠神经干细胞增殖的抑制作用［J］. 第四军医大学学报，2004；25（4）：297-300.

　　Zhang X, Lin LB, Ji XT, et al. Ectogenic nitric oxide inhibits proliferation of neural stem cells in mice ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（4）：297-300.

　　［8］ 姚柏春，黄翔. 胚胎小鼠纹状体神经干细胞的体外培养和分化［J］. 解剖与临床，2004;9（4）:238-240.

　　Yao BC, Huang X. Cultivation and differentiation of embryonic striatumneural stem cells in vitro ［J］. Anatomy Clinic, 2004；9（4）：238-240.

　　［9］ 崔景彬，鄢文海，王建枝，等. 维甲酸和EGF对大鼠脑胚胎神经干细胞增殖和分化的影响［J］. 中国组织化学与细胞化学杂志，2003；12（1）：81-85.