丙型肝炎病毒不同片段抗体蛋白芯片的制备及评价
【关键词】 肝炎病毒
Preparation and evaluation of proteinchip for different HCV antibody detection
【Abstract】 AIM: To prepare and evaluate the clinical application of proteinchip for different hepatitis virus C (HCV) antibodies. METHODS: Proteinchip for different HCV antibodies was established by coating chimeric antigen and the 4 segments of HCV antigens on the slide. The results of this method were compared with those of RIBA and ELISA. RESULTS: The negative result and the positive result of proteinchips of chimeric antigen accorded with ELISA were 93.8 % and 97.1%, respectively. When it came to RIBA, the accordance rate was 96.9 % and 98.5%, respectively. The accordance rates of negative and positive results of proteinchip of the 4 segments of HCV antigens with ELISA were 96.8% and 97.1%, respectively, while they turned out to be 100% and 98.5% with RIBA. CONCLUSION: The proteinchip for different HCV antibodies has a high accordance rate with RIBA（P<0.05）. Proteinchip for different HCV antibodies has high accuracy and can decrease the false positive rate.
【Keywords】 hepacivirus; protein array analysis; antibodies
【摘要】 目的： 制备丙型肝炎病毒（hepatitis virus C, HCV）不同片段抗体蛋白芯片，并对其临床应用价值进行评价. 方法： 分别取HCV融合抗原及分片段抗原，点至醛基化玻片上，制成HCV不同片段抗体蛋白芯片. 进行抗HCV（ELISA）试剂和RIBA试剂与蛋白芯片法的比较. 结果： 蛋白芯片的融合抗原检测与ELISA法相比，阴性符合率为93.8 %，阳性符合率为97.1% . 蛋白质芯片分片段检测与ELISA法相比，阴性符合率为96.8 %，阳性符合率为97.1%. 蛋白芯片的融合抗原检测与RIBA法相比，阴性符合率为96.9% , 阳性符合率为98.5 %. 蛋白芯片分片段检测与RIBA法相比，阴性符合率为100%, 阳性符合率为98.5%. 结论： 蛋白芯片法与RIBA试剂检测结果相比较，与RIBA试剂有良好的一致性（P<0.05）)，证明其具有良好的检测准确率,并可以降低ELISA法的假阳性.
【关键词】 肝炎病毒；蛋白质陈列分析；抗体
0引言
近年来，丙型肝炎病毒（HCV）不同编码区抗体检测成为一个热点［1，2］. 虽然目前国外都用RIBA3.0试剂作为HCV的确认试剂，但是其有价格昂贵、操作复杂等诸多不足. 丙肝患者的确诊、献血员筛选、药物的研发、患者的追踪观察迫切需要更先进、更简便、更廉价的诊断试剂的问世，为此我们进行了HCV不同片段抗体蛋白芯片的实验研究, 获得了较满意的结果.
1材料和方法
1.1材料
美国Cartesian点样仪；美国ScanArray4000B 扫描仪；基因工程表达的HCV融合抗原、核心抗原（C区）、NS4抗原、NS5抗原（医学院病毒所）；基因工程表达的NS3抗原C7（日本东燃公司）；CY3抗人IgG 结合物（美国Sigma 公司）；不同片段抗体标准品由深圳赛尔生物技术有限公司惠赠；RIBA3.0试剂，载玻片（美国Chiron公司）；抗HCV（ELISA）试剂（上海永华细胞和基因高技术分析中心）；血清标本99例，均来源于西安大学第一和第二医院门诊及住院患者.
1.2方法
1.2.1包被和封闭将融合抗原及各片段抗原配成不同浓度，用点样仪将其点样于醛基化玻片上，37℃温浴2 h后晾干. 用含100 mL/L 小牛血清的PBS(0.01 mmol/L PBS, pH 7.2) 37℃封闭2 h，晾干放于4℃冰箱过夜后备用.
1.2.2检测取出制备好的芯片，加1∶10倍稀释血清10 μL， 37℃水浴30 min， PBST（0.01 mmol/L PBS, pH 7.2, 0.5 mL/L Tween 20）洗涤5次，然后加CY3抗人Ig G 结合物10 μL ， 37℃水浴30 min，PBST洗涤5次后，用ScanArray4000B扫描仪扫描.
1.2.3结果判断不同片段中有一个阳性判为可疑，两个或以上片段阳性则判为阳性标本.
统计学处理： 方法准确性判断采用Youden指数，方法一致性判断采用Kappa值.
2结果
2.1实验条件选择用棋盘滴定法进行抗原浓度、样品稀释倍数及CY3抗人Ig G 结合物浓度的确定. 不同浓度的各片段抗原点样，测试标准品并与RIBA试剂比较，符合率最高者为点样浓度. 结果以融合抗原100 μg/L, C区抗原100 μg/L, NS4抗原50 μg/L, NS5抗原50 μg/L为最佳. 样品稀释倍数以1∶10为宜. CY3抗人Ig G 结合物浓度测定以1∶500为最佳浓度.
2.2重复性和稳定性试验将上述包被好的蛋白芯片分别置于4℃冰箱和室温下贮存7 d和1, 3, 6 mo后取出 ，用上述方法分别检测20例阳性标本和正常对照，结果与新鲜包被的蛋白芯片一致.
2.3特异性试验取甲肝抗体阳性、乙肝表面抗体阳性、巨细胞病毒抗体阳性、类风湿因子阳性血清各20份，用本试剂检测，结果均为阴性.
2.4不同丙肝抗原片段Cutoff值（S /n ）的确定检测407例正常人血清，每种抗原的平均荧光强度，求得信噪比. 各片段阴性对照的信噪比应小于2.5. Cutoff值等于各片段阴性对照平均值加3倍标准差，片段信噪比大于Cutoff值时该片段抗体为阳性（Tab 1）.表1不同丙肝抗原片段的均值、标准差和Cutoff值（略）
2.5考核评估蛋白芯片各片段检测与RIBA确证试剂进行比较，结果见Tab 2. 表2HCV蛋白芯片与RIBA各区段抗体检出比较（略）
2.6抗HCV（ELISA）试剂和蛋白芯片法的比较抗HCV（ELISA）试剂检测样本99例，其中阳性标本69例, 阴性30例. 30例抗HCV ELISA 试剂检出的阴性样本，蛋白质芯片的融合抗原检测均为阴性，蛋白质芯片的分片段检测均为阴性；69例抗HCV ELISA 试剂检出的阳性样本，蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例，阴性2例；蛋白芯片分片段检测根据不同片段中有1个阳性判为可疑，2个或2个以上阳性则判为阳性标本的判定标准，蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例，阴性1例，可疑标本1例. 统计学分析表明，蛋白芯片的融合抗原检测与ELISA法相比，阴性符合率为93.8 %，阳性符合率为97.1%, 具有较好的一致性（Kappa 值=0.953, P<0.05）. 蛋白质芯片分片段检测与ELISA法相比，阴性符合率为96.8 %，阳性符合率为97.1%，具有较好的一致性（Kappa 值=0.954, P<0.05）.
2.7RIBA试剂和蛋白芯片法的比较RIBA试剂检测样本99例，其中阳性标本66例, 阴性31例，可疑标本2例. 蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例，阴性32例. 蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例，阴性31例，可疑标本1例. 统计学分析表明，蛋白芯片的融合抗原检测与RIBA法相比，阴性符合率为96.9% , 阳性符合率为98.5 %. 具有较好的一致性（Kappa 值=0.955, P<0.05）. 蛋白芯片分片段检测与RIBA法相比，阴性符合率为100%, 阳性符合率为98.5%，具有较好的一致性（Kappa 值=0.978, P<0.05）.
2.83例不符合样本的RIBA试剂及PCR检测对3例不符合样本的RIBA试剂及PCR检测结果见Tab 3.表3不符合样本3例的检测结果（略）
3讨论
蛋白芯片是近年伴随基因芯片起来的一项新技术［3,4］，这项技术是将蛋白质的分析微缩到小型芯片上，利用荧光或酶显色进行检测，并用电脑进行分析. 该技术在对抗原抗体检测、疾病诊断、药物开发等研究方面显示出快速、高效、高通量处理信息的能力.
我们使用醛基化玻片作为载体，进口激光共聚扫描仪进行荧光强度扫描，进行了HCV不同片段抗体蛋白芯片的实验研究, 并用自制的蛋白芯片对99例标本进行检测. 蛋白质芯片分片段检测与ELISA法相比，阴性符合率为93.8 %，阳性符合率为97.1%. 此结果与报道基本一致［5］. 3例抗HCV ELISA 试剂检测阳性样本，蛋白芯片分片段检测检出阳性1例，阴性1例，可疑1例；免疫印迹法RIBA检出阳性1例，可疑2例. 说明蛋白质芯片与RIBA试剂结果有良好的一致性，证明其具有良好的检测准确率，并可以降低ELISA法的假阳性. 对99例标本的检测，蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例，阴性32例. 蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例，阴性31例，可疑标本1例. 融合抗原与分段抗原检出病例结果基本一致，只有1例融合抗原阴性，而单片段阳性的结果，这说明了分片段检测的必要性. 其原因可能是融合抗原是C, NS3, NS4, NS5编码区混合抗原，由于抗原不同，不同抗原组合时抗原片段浓度不同，以及载玻片吸附抗原有限，可以造成抗原配伍不合适或抗原相互干扰，从而影响抗原决定簇位点的充分暴露，造成漏检. 蛋白质芯片法检出的1例可疑标本，免疫印迹法RIBA检出的2例可疑标本均为单独C区阳性，其抗NS3, NS4, NS5均阴性，而PCR结果均为阳性. 此结果提示C区可能与病毒复制有关. 应进一步扩大例数进行观察.
通过对100份抗HCVELISA阴性的其他肝病血清，20份巨细胞病毒阳性血清，20份类风湿因子阳性血清，218份正常人血清，用本试剂进行检测，结果均为阴性，证明该试剂与其他肝炎病毒抗体无交叉反应，且不受类风湿因子、巨细胞病毒的影响，具有较好的特异性. 对载玻片进行特殊处理后，蛋白质抗原与片基结合稳定，并保持原活性状态，HCV不同片段抗体蛋白芯片的稳定性及重复性获得满意结果，试剂的稳定性可达1 a，较成熟的技术使其具有了较好的开发前景.
【文献】
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