人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

         作者：蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊，汪蕾

【关键词】  腺病毒科

    Construction and identification of human HCN4 gene recombinant adenovirus

　　【Abstract】 AIM: To construct the recombinant adenovirus of human HCN4 gene. METHODS:  HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV to form the transfer vector by the methods of homogeneous recombination in bacteria and the recombinant adenovirus was then transfected into 293 cells using Lipofectamine 2000. The target gene was detected by polymerase chain reaction (PCR) and the titer and its infection rate were determined using the green fluorescent protein (GFP) expression in the shuttle plasmid. RESULTS:  Restriction enzyme digestion analysis and the sequence analysis confirmed that the HCN4 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was 2.0×1015 pfu/L. GFP was observed in the transfected 293 cells under a fluorescent microscope. CONCLUSION:  The recombinant adenovirus containing human HCN4 gene is successfully constructed by the method of homogeneous recombination in bacteria.

　　【Keywords】 HCN gene; adenoviridae;  recombination, genetic

　　【摘要】 目的： 构建超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN4）重组腺病毒载体. 方法： 采用基因工程技术，将HCN4 cDNA定向克隆至穿梭载体pAdTrackCMV中，利用pAdeasy1系统进行细菌内同源重组后，脂质体转染293T细胞包装、扩增，CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因，对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果： 测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体，病毒滴度达2.0×1015pfu/L. 结论： 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.
 
　　【关键词】 HCN基因；腺病毒科；重组，遗传

　　0引言

　　起搏电流（If）在窦房结生理性起搏机制中担当重要角色，同时也是自主神经调节心脏节律的主要靶点，其编码基因为超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN）［1-4］. HCN超家族包括HCN1～HCN4型，其中HCN4占窦房结HCN总mRNA的80%［5］. 最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系中存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］. 为了进一步深入研究HCN4的通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因，我们构建了表达HCN4的重组腺病毒载体.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　腺病毒细菌内同源重组系统包括E.coli Bj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒骨架质粒pAdeasy1（美国Johns Hopkins大学Dr. He TC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏中心）；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（Gibco BRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Promega公司）；质粒提取试剂盒（Hispeed Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司）；氯化铯（Sigma公司）. 其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂.
 
　　1．2方法

　　1．2．1穿梭载体pAdTrackCMV HCN4的构建和鉴定

　　1．2．1．1pAdTrackCMVHCN4的构建质粒pcDNA3.1HCN4用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收4.7 kb的HCN片段. 穿梭质粒pTrackCMV用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收载体骨架，T4 DNA连接酶连接载体骨架与目的基因片段得到重组质粒pTrackCMVHCN4. 转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒提取质粒.

　　1．2．1．2pAdTrackCMVHCN4的酶切鉴定取0.5 mL离心管，依次加入酶切缓冲液2 μL，内切酶HindⅢ 0.5 μL，内切酶XbaⅠ 0.5 μL, 重组质粒0.5 μL，去离子水16.5 μL，充分混匀，37℃水浴2 h，酶切后10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带.

　　1．2．2细菌内同源重组产生腺病毒质粒用100 mL/L的冰冷的无菌甘油制备E.coli BJ 5183及E.coli DH5α电穿孔感受态菌，将穿梭质粒pAdTrackCMVHCN4用PmeⅠ线性化，纯化回收酶切产物. 分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy1等浓度比混合，在2500 V, 200 Ω, 25 μF条件下，电转化BJ5183感受态菌，卡那霉素（50 mg/L）固体LB培养基筛选，16 h后挑取10个克隆，提取质粒. PacⅠ酶切鉴定阳性克隆得到重组腺病毒质粒pAdHCN4. 重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定： 以质粒提取试剂盒提取的高纯度质粒为模板，双脱氧核苷酸终止法测序，以SP6Promter Primer为测序引物，采用ABI PRISM B DyeTM测序试剂盒在ABI PRISMTM377XL DNA sequncer序列分析仪上对插入片段进行序列测定.
 
　　1．2．3293细胞中包装产生重组腺病毒利用HEK293细胞可稳定表达复制缺陷病毒Ad5 E1基因的特性，将重组病毒质粒包装成有完整功能的重组病毒颗粒. 转染前24 h于每个T25 cm2培养瓶中接种1×106细胞，转染时细胞密度为50%～70%. 转染当日，将4 μg pAdHCN4质粒用PacⅠ酶切线性化，用20 μL Lipofectamine 2000按说明转染293细胞，2 d后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，2 wk后收集细胞. -70℃/37℃/Vortex反复冻融4次，取1/5病毒提取上清再感染293细胞扩增，3~4 d后收集细胞，PBS重悬，反复冻融，离心收集病毒上清，保存于-80℃.
 
　　1．2．4重组腺病毒大规模扩增及CsC1密度梯度超速离心纯化按照上述方法连续扩增病毒5~6轮，最后共感染了大约3×108个293细胞，3~4 d后收集病毒上清，制备CsC1低密度母液（1200 g/L）和高密度母液（1460 g/L）. 将高、低密度母液以及病毒上清加至超速离心管中，以10 000 g于4℃离心3~4 h，侧向穿刺小心吸出病毒条带，加入透析袋中透析12 h，其间更换透析缓冲液（10 mmol/L TrisHC1 pH 8.0, 1 mmol/L MgC12, 10 mL/L甘油）3次，透析完全后，用2×病毒储存液（19 mmol/L TrisHC1 pH 8.0, 100 mmol/L NaC1, 1 mL/L BSA, 50 mL/L甘油）按1∶1稀释病毒，0.22 μm滤膜过滤，分装后放-80℃保存，得到纯化好的病毒AdHCN4.
 
　　1．2．5病毒滴度测定先用A值初步估算： 取15 μL纯化好的病毒用0.435 mL H2O稀释15 μL高密度CsC1母液作为空白对照，测A260 nm值，按1012/VP/A260 nm进行换算. 再以GFP法进行测定： 将病毒储存液作不同比例的稀释，取500 μL稀释液加至T25 cm2培养瓶培养的293细胞中，于37℃吸附30 min换新鲜培养基继续培养36 h，在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，按病毒滴度（pfu/mL）=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/0.5 mL.

　　1．2．6重组腺病毒的鉴定目的基因的PCR鉴定，根据HCN4 cDNA的碱基序列，设计了HCN4的寡聚核苷酸引物： 正向引物： 5′GGCATGTCCGACGTCTGGCTCA3′；反向引物： 5′TCACGAAGTTGGGGTCCGCATT GG3′. 提取病毒基因组DNA： 2 mL PBS收集2种病毒感染后发生病变的293细胞，冻融4次，于4℃ 600 g离心10 min取上清，加入200 μL蛋白酶K （5 g/L），并加入2 mL  SET裂解液（10 mL/L SDS, 10 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris HCl pH 8.0），56℃消化2 h, 3000 g离心10 min取上清，等体积的酚/氯仿抽提一次，无水乙醇沉淀，20 μL TE溶解，以上述病毒基因组DNA为模板，进行PCR: 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s，共35个循环，最后于72℃延伸10 min，产物用10 g/L琼脂糖电泳进行鉴定.

　　2结果

　　2．1穿梭载体pAdTrackCMVHCN4的鉴定重组质粒被切成的片段与理论预期一致，表明HCN4 cDNA序列已成功插入pAdTrackCMV载体中，且连接正确（Fig 1）.

　　2．2重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定用一条PCR鉴定引物进行测序，测定序列结果与GenBank报道的序列完全一致（Fig 2）.

　　2．3重组腺病毒在293细胞中包装、扩增及纯化将腺病毒质粒pAdHCN4用PacⅠ酶切线性化后转染293细胞，2~3 d后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达，说明有感染力的病毒颗粒包装成功（Fig 3）. 将大规模扩增所得到的病毒液经过CsC1密度梯度超速离心的方法进行纯化，并经过透析得到可以直接用于在体实验的重组腺病毒AdHCN4.

　　2．4病毒滴度的测定应用A值和GFP法测得AdHCN4最终的滴度为2.0×1015pfu/L.

　　2．5重组腺病毒AdHCN4中HCN4基因的PCR鉴定提取AdHCN4病毒基因组DNA， 以HCN4基因的引物进行PCR鉴定，结果AdHCN4可见353 bp的阳性扩增条带，而AdGFP没有条带（Fig  4）.

　　3讨论

　　心律失常是影响人们健康威胁人们生命的疾病. 心律失常遗传基因的发现以及突变监测的进展促进了心律失常基因的研究. 最近的研究结果都提示HCN4基因是具有很大潜力的基因治疗的靶基因： ① 在遗传性窦房结功能障碍患者存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］；② 在HCN4基因敲除的鼠胚胎心脏记录不到具有4期自动除极特征的起搏细胞动作电位，胚胎不能发育成熟［8］；③ 胚胎心室肌细胞在早期阶段（E9.5）具有自发除极能力，晚期（E19.5）则丧失起搏能力，其机制在于HCN4表达持续性下调及If进行性减少［9］. 因此，HCN4转染的心肌细胞将过度表达If从而具备4期自动除极能力，这将可能构建建立在基因工程基础上的生物起搏器. 我们成功的构建了重组腺病毒载体AdHCN4，可以通过腺病毒载体将HCN4导入体外培养的细胞深入研究HCN4通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，也可以心肌内注射开展窦房结功能障碍的基因治疗，为今后的临床应用奠定坚实的基础.

     由于腺病毒载体的病毒滴度高、容量大、转导效率高、感染范围广以及稳定性好，因此被广泛应用于各种基因治疗中. He等［10］首次介绍细菌内同源重组法，此方法简便快捷，实验周期短，极大地方便了构建重组腺病毒. 目前美国Johns Hopkins Oncology Center制备了含腺病毒核心基因组pAdEasy1的BJ5183细菌，即AdEasy1（亦称作BJAEasy或AdEasier细菌），与pAdTrack或pAdTrackCMV等穿梭质粒共同组成一个高效重组腺病毒构建系统，只需将含目的基因的穿梭质粒线性化后转化AdEasy1获得重组腺病毒质粒，再经293细胞包装、扩增便可获得所需重组腺病毒，因此选用该系统进行目的基因的修饰在时效上有很大优势.

　　我们希望能够以腺病毒载体为介导，进一步研究HCN4基因在生理性起搏中的功能角色及其分子机制，探索HCN4基因作为基因治疗靶基因的价值，为窦房结功能障碍和重度房室传导阻滞的基因治疗提供候选基因，并为临床前研究提供实验依据. 我们在前一阶段的研究中曾通过窦房结细胞移植来修复或重建心脏优势起搏点以完全或部分代替窦房结功能［11，12］. 但由于人的胚胎心肌细胞移植受到伦争议，限制了其在临床上的应用. 由于建立在基因工程基础上的“生物起搏器”可以进行大规模生产，有望成为比起搏器更便宜、更安全、更灵敏、创伤更小、更适宜于儿童治疗的新选择，具有广阔的临床应用前景和巨大的社会效益.

　　【】

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