犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养后细胞表型变化

【关键词】  ,间质干细胞

    Primary study of cell phenotype of isolated and cultured canine bone marrow mesenchymal stem cells in vitro
　　【Abstract】 AIM: To observe the phenotype changes and biological characteristics of naturally differentiated canine bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and differentiated after induced with bFGF in vitro. METHODS:  BMSCs were isolated and purified from the canines bone marrow by Percoll density gradient centrifugation and by adhering to the culture plastic. After successive culture and amplification, the growth curve was drawn. The morphology was observed under phase contrast microscope and some antigens were examined by immunohistochemistry stain. RESULTS:  SH2, Vimentin, αSMA, collagen Ⅰ and Ⅲ were all positively expressed in naturally differentiated BMSCs, with the positive percentages (95.1±1.7)%, (64.4±2.2)%, (78.7±0.9)%, (78.3±1.4)% and (66.8±0.8)%, respectively. CD34, Ⅷ antigen and laminin displayed negative reaction. The induced and differentiated cells showed positive staining of lamininn ［(50.2±2.5)%］. The positive expression of  αSMA decreased to (42.3±1.6)% and that of vimentin increased to (86.2±2.4)%. CONCLUSION:  The phenotypes and biological characteristics of naturally differentiated myofibroblast with canine BMSCs show that they are more active than those of fibroblasts and more suitable to be used as seedcells in constructing tissue engineering heart valve (TEHV).

　　【Keywords】 mesenchymal stem cells; bone marrow; tissue engineering; immunohistochemistry; canine

　　【摘要】 目的： 观察犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）经分离、扩增及诱导分化后表型变化和生物学特性. 方法： 利用骨髓穿刺、percoll密度梯度法离心分离继而贴壁筛选纯化BMSCs进行接种培养，体外扩增；倒置显微镜下观察其形态学变化，并进行相关抗原检测. 结果： 分离的细胞免疫组化显示SH2, Vimentin, αSMA和 collagen Ⅰ, Ⅲ均呈阳性表达，其阳性率分别为(95.1±1.7)%, (64.4±2.2)%, (78.7±0.9)%,  (78.3±1.4)%和(66.8±0.8)%；CD34,Ⅷ因子antigen 和laminin的表达均为阴性. 在加入bFGF等诱导培养基作用下，可以诱导分化出成纤维细胞，其诱导分化率为(50.2±2.5)%. 诱导后αSMA表达阳性率下降为(42.3±1.6)%，vimentin表达阳性率上升为（86.2±2.4）%，生长扩增能力强，2 wk内经3代培养即可扩增到(5.6±0.3)×107细胞数量级.  结论： 此实验自然分化扩增来的肌纤维母细胞的表型和生物学特征显示这类间质细胞较应用bFGF诱导、分化扩增来的成纤维细胞有更强活力，且分泌胶原力强，更符合构建组织工程种子细胞的要求.

　　【关键词】 间质干细胞；骨髓；组织工程；免疫组织化学；犬

　　0引言

　　获取理想种子细胞是当今组织工程心脏瓣膜（TEHV）研究热点之一. 既往一般采用管源性（包括成纤维细胞和内皮细胞等），它们需要牺牲供体完整的血管组织作代价，而且，血管来源的种子细胞和自然瓣膜间质细胞相比在细胞表型上还存在不少差异［1］，这和TEHV的和长期的功能密切相关［2］. 我们选择犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为种子细胞，就其生物学特性和细胞表型变化进行研究.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康杂种犬6只，(12±3) mo龄，由第四军医大学动物实验中心提供；DMEMLG(Dulbecco Eagles minimum essential medium，改良Eagles培养液，低糖型）培养基，新生牛血清（FBS），胰蛋白酶(美国，Gibco公司)；MCDB201培养基，细胞培养专用青、链霉素、两性霉素B混合液，MTT ［3(4,5dimethylthiazol2yl)2,5diphenyltertrazolium bromide四唑盐］(美国，Sigma公司)；percoll分离液(含乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒1.073 kg/L，美国，Pharmecia公司)；DMSO (dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜，美国，Amresco公司)；SH2 mAb(Src homology 2，美国，BD公司)；Ⅰ, Ⅲ型胶原mAb (NIDCR惠赠,美国)；Vimentin, αSMA, CD34, Ⅷ 因子,Laminin mAb， PBS (phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液)， PV9000二步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京，中山生物技术有限公司)；倒置相差显微镜(德国，Leica公司)；CO2细胞培养箱(HERAcell，德国，Heraeus公司)；酶联免疫检测仪(美国，μQuant公司)；图像分析：Leica Q570c真彩色图像分析系统(德国，Leica公司)，数码摄像机(JVCky30FB CCD,日本，JVC公司).

　　1.2方法

　　1.2.1细胞原代培养与传代无菌条件下通过犬双侧股骨大转子穿刺获取骨髓原液10~15 mL/犬，重悬于20 mL DMEMLG(含青霉素105 u/L，链霉素100 mg/L，两性霉素B的混合液25 μg/L)，以900 g离心10 min，弃上清，DMEMLG重悬至6 mL/管，混匀；另取10 mL离心管，预加3 mL percoll液，将两者缓慢叠加，以900 g离心30 min；取交界白膜层，加DMEMLG洗涤2次；再以含100 mL/L FBS，青、链霉素、两性霉素B混合液的DMEMLG： MCDB201 6∶4混匀接种于50 mL培养瓶. 当MSC细胞贴壁、扩展、生长时弃去非贴壁细胞. 在24, 72 h和以后的每3 d更换培养基. 细胞传代及扩增均置于37℃, 50 mL/L CO2, 100%相对湿度的细胞培养箱中进行. 在细胞约铺满80%左右时用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，按1：3的比例传代接种.

　　1.2.2形态学观察用倒置相差显微镜逐日观察培养细胞的生长状况和形态变化；细胞生长曲线的测定(MTT法)：称取250 mg MTT +50 mL PBS搅拌30 min，经0.22 μm过滤器过滤除菌，分装，4℃保存；取第1, 3, 5, 7和9代(分别记为P1, P3, P5, P7和P9)细胞，分别接种于7块96孔板内(平底型)，2.5 g/L胰酶消化，以含100 mL/L FBS的DMEMLG、MCDB201混合培养基制成单细胞悬液，在培养板上按每孔约103细胞，体积200 μL，每块板接种11孔，余1孔滴加相同体积的培养基作为空白对照，于37℃, 50 mL/L CO2,饱和湿度条件细胞孵箱中培养7~8 d；每24 h取1板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37℃继续孵育4 h，去上清，每孔加入150 μL DMSO，终止培养，振荡10 min，使结晶完全融解；选择490 nm波长进行比色，在酶联免疫检测仪上测定每孔吸光度值(A值)，记录结果，横轴为时间，纵轴为A值，以对照孔调零. 绘制细胞生长曲线. 以Patterson公式Td＝Tlog2/log(Nt/No)细胞在对数生长期的群体倍增时间［3］.
 
　　1.2.3免疫细胞化学观察相关免疫细胞化学检查包括Vimentin, αSMA, Ⅰ, Ⅲ型胶原，SH2, CD34, Ⅷ因子，Laminin等. 常规进行细胞爬片，以40 g/L多聚甲醛液固定30 min后，按照试剂盒说明进行如下免疫组化操作：30 mL/L H2O2室温孵育10 min，10 mmol/L的PBS洗5 min×3次，加正常山羊血清，置切片于湿盒内37℃孵育10 min，甩干，加一抗，湿盒内4℃过夜. PBS洗5 min×3次，加试剂1（polymer helper）100 μL，37℃孵育20 min，PBS洗5 min×3次. 加试剂2（polyperoxidase）标记的二抗，湿盒内37℃孵育30 min. PBS洗5 min×3次，DAB显色5~30 min，蒸馏水终止显色，用苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片.

　　1.2.4计算免疫组化阳性细胞百分率随机抽取P1, P3, P5, P7和P9代BMSCs细胞阳性片中每5个高倍视野，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，得出免疫染色阳性细胞的百分比［4］.
统计学处理： 统计数据采用医用统计软件包SPSS11.0分析，多个样本均数间的比较应用OneWay ANOVA检验及LSDt检验. 结果用x±s表示，P<0.05为差异有统计学意义. 用Microsoft Excel作图.

　　2结果

　　2.1细胞形态① 原代培养： 12 h后可见少量细胞贴壁，并混有较多造血系细胞及部分破碎细胞残片悬浮，24 h换液去除悬浮细胞，贴壁细胞明显增多，呈圆形、类圆形或多角形，个别形态开始伸展. 胞核质分界清晰，折光性强. 胞核单个，位于胞体中央. （Fig 1A）. 72 h细胞基本纯化，均为贴壁细胞，大量细胞形态伸展为长梭形，尚存有不少圆形或类圆形细胞. 低倍镜下局部呈集落式生长（Fig 1B）. 贴壁细胞生长迅速，约7 d接近铺满汇合，此时细胞相互间紧密贴附，低倍镜下局部形成漩涡状（Fig 1C）；② 传代培养：  BMSCs传代后生长加速，一般3～4 d可传代1次，形态多呈长梭形. 10～15 mL/犬的骨髓在14 d经 3代培养后即可达到 (5.6±0.3)×107细胞数量级，能满足组织工程种子细胞的需求. 可传15代，10代以前细胞的形状较为稳定，细胞增殖速度较快，10代以后，增殖能力逐渐减弱，生长速度也逐渐减慢，细胞胞体逐渐变大，细胞内空泡和颗粒状物质逐渐增多，渐进入退变期（Fig 1D）.

　　2.2生长曲线以横轴为时间，纵轴为比色结果A值绘制生长曲线（Fig 2）. 生长曲线显示：各代次的细胞生长曲线基本一致，为类“S”形. 在相同培养条件和环境下，潜伏期一般不超过1 d，细胞倍增时间（Td）为49 h. 培养后第3~4日达到对数生长期，第5~7日进入平台期；传代细胞与原代培养细胞差别不明显，而细胞持续传代至第10代细胞时，生长速度有所减缓，每代细胞的生长过程分为3个阶段： 生长缓以上指标说明体外培养的BMSCs细胞生长增殖旺盛，生物学性状稳定.

　　2.3免疫组化测定BMSCs免疫细胞化学染色显示SH2, Vimentin, αSMA和collagen Ⅰ, Ⅲ呈阳性表达（Fig 3AE）. 阳性细胞表现为胞质呈棕黄色至棕褐色，细胞核周围较明显. 以PBS代替一抗为阴性对照组，均未着色(Fig 3 F). CD34, Ⅷ因子,Laminin染色均阴性.