人抗HBsAg单链抗体

【关键词】  肝炎表面抗原

    Gene construction and expression of human antiHBsAg singlechain FvTat fusion protein in E. coli

　　【Abstract】 AIM:  To construct a fusion gene of human antiHBsAg ScFvTat and to analyze the binding activity and internalization of ScFvTat fusion protein after its expression in E. coli. METHODS:  Two oligonucleotide primers were designed and used to amplify the ScFv gene. The construction was cloned into expression vector pTATHA containing the protein transduction domain Tat. The expressed protein was detected by SDSPAGE and Western blot and purified by affinity chromatography. The binding specificity of the ScFvTat fusion protein was confirmed by indirect ELISA and specific internalization of the ScFvTat fusion protein was confirmed by immunocytochemistry staining after the purified protein was incubated with HBsAg positive or negative hepatocellular carcinoma cells. RESULTS:  Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that ScFv gene was correctly cloned into expression vector. SDSPAGE and Western blot analysis showed that ScFvTat fusion protein was successfully expressed in E. coli BL21. Indirect ELISA and competition inhibition ELISA confirmed that the expression products had antigen specific binding activity. ScFvTat fusion protein was specifically internalized into HBsAg positive hepatocellular carcinoma cells. CONCLUSION:  The antiHBsAg ScFvTat fusion protein expressed in E. coli can specifically internalize into HBsAg positive hepatocellular carcinoma cells.

　　【Keywords】 single chain antibody; hepatitis B surface antigens; internalization; genes, Tat

　　【摘要】 目的： 构建人抗HBsAg单链抗体Tat蛋白转导结构域（ScFvTat）融合基因，在大肠杆菌中进行表达，并分析ScFvTat融合蛋白的活性及内化情况. 方法： 设计引物扩增人抗HBsAg单链抗体基因，克隆入含有蛋白转导结构域Tat序列的原核表达载体pTATHA，在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达. 表达产物用SDSPAGE及Western blot鉴定，用亲和层析柱纯化. 间接ELISA和ELISA竞争抑制实验分析ScFvTat融合蛋白的亲和活性，将纯化蛋白与HBsAg阳性或阴性肝癌细胞共孵育后，免疫细胞化学染色分析ScFvTat融合蛋白的结合及内化情况. 结果： 成功地构建了人抗HBsAg单链抗体Tat融合蛋白的原核表达载体，在IPTG诱导下获得了表达，表达的ScFvTat融合蛋白具有与HBsAg结合的活性，并且能够特异性内化入HBsAg阳性肝癌细胞. 结论： 单链抗体与Tat蛋白转导结构域融合后，实现了ScFvTat融合蛋白的特异性内化，为该单链抗体的进一步应用奠定了基础.

　　【关键词】 单链抗体；肝炎表面抗原，乙型；内化；基因，Tat

　　0引言

　　单链抗体（ScFv）及其与效应分子的融合体能否高效地内化入细胞对于其应用非常关键. Tat是新近发现的一种能高效穿膜的短肽［1,2］，它能将携带的多肽、蛋白质、DNA及性药物等导入几乎所有的组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障［3］. Tat融合蛋白系统被认为是一种很有效的运载工具. 我们将前期实验中获得的一株ScFv［4］与Tat短肽融合，将其改造成穿膜抗体（Transbody）［5］，在大肠杆菌BL21诱导表达后，对ScFvTat融合蛋白的亲和活性以及内化情况进行了分析，为应用该ScFv靶向治疗乙型肝炎奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　质粒pEGFPN3HBs11由第四军医大学免疫学教研室构建［4］；pTATHA载体、稳定表达HBV的人肝癌细胞系HepG2.2.15由第四军医大学病原生物学教研室惠赠；大肠杆菌DH5α, BL2l(DE3)LysS为第四军医大学免疫学教研室保存；人肝癌细胞系HepG2由第四军医大学病教研室惠赠；限制性内切酶、连接酶及IPTG为Takara公司产品；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒为上海华舜生物技术有限公司产品；HiTrap NiNTA亲和层析柱为美国Amersham公司产品；6His mAb为第四军医大学免疫学教研室制备；HRP羊抗鼠IgG为武汉博士德生物有限公司产品；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒为美国Pierce公司产品；组织化学染色试剂盒为福州迈新生物有限公司产品.

　　1.2方法

　　1.2.1引物的设计与合成根据已有的抗体序列,我们设计了相应的引物,分别引入了XhoⅠ与EcoRⅠ酶切位点.引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成,序列如下: 5′端引物: 5′TTTCTCGAGGAGGTGCAGCTGGTGGAG， 3′端引物:5′TTTGAATTCTTATCGATTGATTTCCACCTT. 其中横线部分分别为XhoⅠ与EcoRⅠ酶切位点，方框内为终止密码子TAA的互补序列.

　　1.2.2ScFv基因重组表达载体的构建及鉴定以质粒pEGFPN3HBs11为模板进行PCR扩增，扩增片段纯化后，用XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切, 连接入表达载体pTATHA中，转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆, 酶切鉴定.对酶切鉴定正确的克隆进行序列测定，测序由北京赛百盛生物技术有限公司完成.测序正确的质粒命名为pTATHAHBs11.

　　1.2.3ScFv融合基因的诱导表达及鉴定将鉴定正确的重组质粒pTATHA HBs11转化大肠杆菌BL21，挑取单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，次日以1∶100接种，37℃培养至A600 nm达0.6左右，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导培养3 h，取1 mL未诱导及诱导菌液离心收集菌体，以PBS重悬，超声裂菌后离心，沉淀重悬于10 mL/L  Triton X100,上清和重悬后的沉淀分别加入等量2×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，离心后取上清进行SDSPAGE分析，凝胶薄层扫描分析蛋白纯度. 同时对表达产物进行Western blot鉴定，蛋白样品经SDSPAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜，以5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，依次加入鼠抗6His mAb（1∶1000稀释，4℃孵育过夜），HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶2000稀释，室温1 h），最后用化学发光试剂盒于暗室条件下X光片感光显影.

　　1.2.4表达产物的分离纯化取100 mL诱导菌离心后,收集菌体,用20 mmol/L  TrisHCl重悬，超声破碎菌体6次（每次2 min，间隔10 s），沉淀用Binding Buffer （20 mmol/L  TrisHCl, 0.5 mmol/L  NaCl, 5 mmol/L咪唑，6 mmol/L 盐酸胍，1 mmol/L   2巯基乙醇，pH 8.0）重悬后过0.22 μm的滤膜，用HiTrap NiNTA亲和层析柱进行纯化与复性，具体步骤按使用说明书进行.

　　1.2.5表达产物的活性检测① 间接ELISA法检测表达产物的抗原结合活性. 具体步骤是: 用HBsAg （10 mg/L）包被ELISA板，4℃过夜，加入不同浓度的稀释样品，37℃孵育1 h，同时设空白和阴性对照，依次加入鼠抗6His mAb（1∶1000稀释）， HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶2000稀释）孵育，TMB显色，终止反应后测定各孔450 nm光吸收值.  ② ELISA竞争抑制实验.取纯化蛋白25 μL，与25 μL PBST稀释的HBsAg(10 mg/L)混匀，加入HBsAg包被的ELISA板孔内，以未加HBsAg的纯化蛋白25 μL（纯化蛋白25 μL和25 μL PBST）为对照，其余步骤同间接ELISA，共设三个复孔.在酶联仪上读取A值并抑制率{抑制率=［1-A（加HBsAg）/A（未加HBsAg）］×100}.  ③ 免疫细胞化学染色检测表达产物的特异性内化.制备HepG2.2.15和HepG2细胞爬片，加入纯化蛋白，使其终浓度为0.5 mg/L, 37℃孵育1 h, 40 g/L多聚甲醛固定30 min, 0.1 mL/L  TritonX100处理，30 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶，再以二抗同源的正常动物血清进行封闭，依次加入一抗、生物素化的二抗和SABC复合物，DAB显色，脱水透明，封片照相.