鱼藤酮对PC12细胞Caspase

【关键词】  帕金森病

    Effect of rotenone on Caspase3, Fas and Fasl and relationship with apoptosis in PC12 cells

　　【Abstract】 AIM:  To investigate the effect of rotenone on Caspase3, Fas and Fasl and relationship with apoptosis in PC12 cells.METHODS: PC12 cells were treated with different concentrations of rotenone and the effect of rotenone on the ratio of apoptosis was tested by flow cytometry. 1.0 μmol/L rotenone was added into PC12 cells culture medium at different times and the protein expression of Caspase3 and Fas/Fasl was also tested using FCM. The morphological changes of apoptosis were observed under transmitting electron microscopy (TEM). RESULTS:  The ratio of apoptosis in control group was 0.0199±0.0020. In the trial groups treated with different doses of rotenone for 2 d, the ratio increased as 0.0305±0.0030, 0.0486±0.0073, 0.0313±0.0041 and 0.0285±0.0031, respectively, significantly different from that in control group (P<0.02). The 1.0 μmol/L rotenone had marked effect (P<0.01). When rotenone concentrations exceeded 1.0 μmol/L, the effects decreased in a dosedependent manner. FI of Caspase3, Fas and Fasl in control group was 1.0±0.03, 1.0±0.02 and 1.0±0.04, respectively. After treatment with 1.0 μmol/L rotenone for 3, 6, 12, 24 and 48 h, the expression of Caspase3, Fas and Fasl was observed in each group. The expression of Fas/Fasl was most significant after rotenone treatment for 6 h （P＜0.01） and the expression of Caspase3 was most significant after rotenone treatment for 12 h（P＜0.01）. The  morphological changes under TEM were  shown as unsmooth membrane, decreased cellular protruding, small ratio of nucleus/cytoplasm, increased space in cytoplasm, increased gap of periphery in nucleus uncertainly, and increased poikilochromatin collected in edge. CONCLUSION:  Rotenone may damage the PC12 cells by activation of Caspase3 and Fas/ Fasl apoptosis pathways.

　　【Keywords】  Rotenone; apoptosis; Parkinson disease; microscopy, electron

　　【摘要】 目的： 探讨鱼藤酮对PC12细胞Caspase3, Fas和Fasl的作用及与凋亡的关系. 方法： 应用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测不同浓度鱼藤酮对体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞株凋亡率的影响，并检测1.0 μmol/L鱼藤酮干预不同时段对Caspase3、Fas/Fasl蛋白表达的影响，透射电镜观察凋亡形态学的改变.  结果： 对照组凋亡率为0.0199±0.0020，经0.1, 1.0, 2.0和3.0 μmol/L不同浓度鱼藤酮干预2 d，凋亡率明显增加其变换值分别为： 0.0305±0.0030, 0.0486±0.0073, 0.0313±0.0041和0.0285±0.0031，与对照组比较有显著差别(P<0.02),实验组中以1.0 μmol/L作用最显著(P<0.01)，当鱼藤酮浓度大于1.0 μmol/L时，其作用呈剂量依赖性递减. 对照组Caspase3, Fas和Fasl FI值分别为1.0±0.03, 1.0±0.02和1.0±0.04；经鱼藤酮干预3, 6, 12, 24和48 h，各组均有Caspase3, Fas和Fasl表达，其中以鱼藤酮干预6 h时Fas/ Fasl表达最明显(P<0.01)，而12 h 时Caspase3表达最明显(P<0.01). 电镜下观察到细胞膜不光滑,细胞突起减少，核质比小，细胞质空间增大，核周隙增大、不规则，异染色质增多、边集. 结论： 鱼藤酮可通过激活Caspase3, Fas/ Fasl凋亡途径损伤PC12细胞.

　　【关键词】　鱼藤酮；细胞凋亡；帕金森病； 显微镜检查，

　　0引言

　　帕金森病(Parkinsons disease, PD)是严重威胁人类生存的神经系统退行性疾病，临床症状主要表现为：静止性震颤、运动迟缓、肢体僵、姿势平衡障碍以及植物神经症状，病情呈进行性加重，这严重限制了患者的活动能力，影响了患者的生活质量，不仅给患者造成了极大的痛苦，也给家庭和社会带来了沉重的负担. 此外，PD的神经病特征主要表现为黑质致密区选择性多巴胺能神经元变性和进行性脱失，部分存活的神经元内出现lewy体. 目前PD病因尚未完全阐明，流行病学研究显示与杀虫剂和其他环境毒素有关［1］. 鱼藤酮作为一种存在的杀虫剂，自20世纪40年代以来一直被视为最安全有效的杀虫剂而广泛用于农业除害. 但是，杀虫剂在使用过程中普遍存在药物高残留的蓄积毒性、杀虫作用、造成环境污染、破坏生态平衡乃至危害人类身体健康等诸多问题. 研究证实，鱼藤酮是抑制线粒体复合物Ⅰ抑制剂;氧化自由基的各种化合物、线粒体功能损伤、兴奋性神经毒作用和细胞结构蛋白的异常操作都可改变凋亡细胞调节的平衡，介导黑质DA能神经元的丢失［2］. 但是,有关鱼藤酮激活Fas/Fasl凋亡途径的研究尚未见报道. 我们选用体外培养大鼠肾上腺嗜酪细胞瘤(PC12)细胞，检测鱼藤酮对PC12细胞Caspase3蛋白酶、Fas/Fasl凋亡途径的影响，并观察细胞凋亡形态学的改变，旨在系统证实该凋亡机制是鱼藤酮神经毒性作用的重要途径之一.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　PC12细胞株由河北医科大学第一中心实验室提供：   DMEM培养基（Gibco美国）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；马血清、多聚赖氨酸(PolyLLysin, Sigma,美国)；鱼藤酮(华美公司，)；谷氨酰胺，triton X100, PI, 枸橼酸钠和RNA酶(Sigma,美国)；Fas抗体，Fasl抗体，Caspase3抗体，FITC荧光素抗体(Scbt公司，美国)；500 g/L戊二醛(天津四通化工厂) .

　　1.2方法

　　1.2.1PC12细胞培养将PC12细胞株悬浮于DMEM培养基（含100 mL/L灭活马血清，50 mL/L灭活胎牛血清，2 mmol/L 谷氨酰胺，100 ku/L青霉素，100 mg/L卡那霉素）中，以5×108/L接种到预先涂上多聚赖氨酸的75 cm2培养瓶中，置于37℃、含50 mL/L CO2、饱和湿度的培养箱中孵育，48 h换液,用于以下实验.

　　1.2.2流式细胞仪检测鱼藤酮对PC12细胞凋亡率的影响将细胞以5×108/L分别传入25 cm2培养瓶，分别设1个对照组、4个实验组，待细胞进入对数生长期，对照组换新鲜培养液，实验组加入鱼藤酮使其终浓度分别为: 0.1, 1.0, 2.0和3.0 μmol/L, 孵育24 h，收集细胞，PBS洗2遍，预冷的700 mL/L乙醇4℃固定备用，准备流式细胞仪测定样品： ① 1000 r/min离心5 min，PBS洗1遍; ②  PI染液 (由PI 10 mg，枸橼酸钠200 mg，RNA酶2 mg，10 mL/L  triton X100 2 mL, 9 g/L 盐水130 mL，用双蒸水稀释至200 mL避光备用)，1  mL进行室温下DNA标记20 min; ③ PBS洗1遍，将各实验组细胞重悬于1 mL PBS中，500目铜网分别过滤，应用FCM（伯乐公司，美国）测定荧光值，每组检测10 000个细胞, 每组实验重复2次.

　　1.2.3流式细胞仪检测Caspase3, Fas和Fasl的表达将细胞以5×108/mL分别传入25    cm2培养瓶，Caspase3, Fas/Fasl各设正常对照组1组，实验组5组. 待细胞呈对数生长时，对照组换新鲜培养液，孵育24 h，实验组加入终浓度为1.0 μmol/L鱼藤酮，分别孵育3, 6, 12, 24和48 h. 收集细胞，PBS洗2遍，预冷的700 mL/L乙醇4℃固定备用，准备流式细胞测定: ① 1000 r/min离心5 min，PBS洗1遍; ② 各实验组分别加入Caspase3, Fas和Fasl一抗100 μL（1∶100稀释），室温下避光孵育30 min；③ PBS洗1遍，分别加入二抗FITC（荧光素）室温下避光孵育30 min；④ PBS洗1遍，将各实验组细胞重悬于 1 mL PBS中，500目铜网分别过滤，应用FCM（美国Deckman Coulter公司）测定荧光值，每组检测10 000个细胞, 每组实验重复2次.

　　1.2.4透射电镜观察细胞核的超微结构将细胞传入6孔板，待细胞贴壁生长达75% ~ 80% 融合时，加入1.0 μmol/L鱼藤酮，孵育48 h，传代法收集细胞，1000 r/min 离心5 min，PBS洗2遍，预冷的20 g/L戊二醛4℃固定2~4 h，5 g/L 锇酸后固定1.5 h，常规系列丙酮脱水，环氧树脂Epon812包埋，超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双染，透射电镜（日本日立H7500）观察.

　　统计学处理：  应用SAS 8.0软件进行数据统计处理. 实验数据(凋亡率数据先进行平方根反正弦变换)用x±s，采用单因素方差(oneway ANOVA)分析，并采用StudentNewmanKeuls q检验进行两两比较.

　　2结果

　　2.1鱼藤酮诱导细胞的凋亡率PI染液主要标记凋亡细胞DNA,对照组凋亡率为0.0199±0.0020(Fig 1A)，经0.1, 1.0, 2.0和3.0  μmol/L不同浓度鱼藤酮干预2 d，凋亡率明显增加，其变换值分别为： 0.0305±0.0030,  0.0486±0.0073, 0.0313±0.0041和0.0285±0.0031，在α= 0.05水准下，除0.1, 2.0, 3.0 μmol/L两两之间比较不具有显著差异外（P＞0.05），其余任两组比较均有显著差异(F =17.67,  P<0.02),实验组中以1.0 μmol/L作用最显著(P<0.01， Fig 1B).

　　2.2鱼藤酮对Caspase3蛋白酶表达的影响用荧光指数FI表示Caspase3蛋白的表达，公式： FI=实验样品均值/正常均值，荧光道数均值=log×85, 对照组为1.00±0.03，实验组加入鱼藤酮使其终浓度为1.0 μmol/L，分别孵育3, 6, 12, 24和48 h,其表达见Tab 1. 实验组中以鱼藤酮干预12 h Caspase3表达最明显,与对照组比较具有显著差异（P<0.0001），说明鱼藤酮可激活Caspase3蛋白酶，但在48 h内，这种蛋白持续存在.

　　2.3鱼藤酮对Fas蛋白的影响各组均有Fas表达，对照组为1.00±0.02，实验组加入鱼藤酮使其终浓度为1.0  μmol/L，分别孵育3, 6, 12, 24和48 h,其表达见Tab 1，实验组中以鱼藤酮干预6 和48 h表达明显，与对照组及其他各实验组比较具有显著差异（F=16.01, P<0.0001）,表明Fas参与细胞的凋亡过程.

　　2.4鱼藤酮对Fasl蛋白的影响Fas配体在各组中均有表达，对照组为1.00±0.04，实验组加入鱼藤酮其终浓度为1.0  μmol/L，分别孵育3, 6, 12, 24 和48 h,其表达见Tab 1,实验组中以鱼藤酮干预6 h时Fasl表达最明显（P<0.0001）,与对照组及其他实验组比较具有显著差异（F= 6.16, P=0.0047）,Fasl表达趋势与Fas比较一致.表1鱼藤酮对Caspase3, Fas和Fasl表达的影响（略）

　　2.5细胞核超微结构的改变镜下观察到PC12所表现的凋亡形态学的改变并不典型，鱼藤酮损伤细胞的程度也不一致,如有的细胞表现为：细胞膜整齐，有小的突起; 微绒毛, 核质比高，内外核膜均匀，常染色质丰富，说明生命活动比较旺盛（Fig  2A）. 而有的细胞则表现为：细胞膜不光滑,细胞突起减少，核质比小，细胞质空间增大，核周隙增大、不规则，异染色质增多、边集（Fig 2B）.

　　3讨论

　　各种因素引起PD最终表现为黑质致密区选择性多巴胺能神经元变性和进行性脱失，神经元细胞的退变可以通过坏死（necrosis）和凋亡（apoptosis）两种途径实现. 研究发现PD患者脑内5%的黑质DA能神经元存在细胞凋亡的特征性病理变化. 因此,探讨鱼藤酮通过激活Caspase3蛋白酶、Fas/Fasl凋亡途径损伤PC12细胞,为理解PD的病因学提供一定的理论依据.

　　已有研究证实，将转染mtDNA的野生型Hela细胞株与呼吸链抑制剂鱼藤酮和抗霉素A共同孵育，结果发现Fas基因的mRNA含量增加了2至4倍，致使细胞对Fas抗体的敏感性增高［3］. Ahmadi 等［4］第一次采用原代多巴胺神经元培养，证实在很低的纳摩浓度水平，鱼藤酮可诱导caspase3调控的凋亡. 此外,氧化应激诱导神经细胞凋亡可能与核因子κB的激活，启动凋亡相关基因cMyc, FasFasl有关［5］. 我们采用FCM检测细胞凋亡率，结果发现不同浓度鱼藤酮干预2 d，可明显增加细胞凋亡的数量，与对照组比较具有显著差别（P<0.0001），其中以1.0  μmol/L鱼藤酮作用最显著（P<0.0001）. 因此,我们选用1.0 μmol/L鱼藤酮干预不同的时间，结果发现Caspase3, Fas和Fasl的表达增加，说明Caspase3蛋白酶、Fas/Fasl凋亡途径参与了鱼藤酮诱导的PC12细胞的凋亡过程. 线粒体功能障碍被认为是执行细胞死亡的中央器官，鱼藤酮抑制线粒体复合物Ⅰ，引起ROS大量产生，损害线粒体膜电位、引发ER钙库释放钙、使细胞内Ca2+浓度持续升高，这些因素共同作用产生凋亡信号, 刺激细胞, Fas/FasL介导的信号途径首先是三聚体的FasL与细胞膜上的Fas受体发生交联而激活DD区，经接头蛋白分子FADD激活FLICE，然后级联激活Caspases蛋白酶，活化的Caspases降解PRAP，Actin,核膜层蛋白等各种底物，最终导致PC12细胞凋亡.

　　Seaton等［6］用鱼藤酮培养人SKNMC多巴胺细胞，观察复合物Ⅰ抑制与细胞的凋亡之间的关系. 结果证实，经0.25～1 μmol/L鱼藤酮培养24~48 h后，SKNMC多巴胺细胞发生典型的凋亡，出现染色体DNA浓缩、DNA断裂、质膜空泡等改变. 然而,我们的实验结果显示: 鱼藤酮引起PC12发生非典型的凋亡,表现细胞膜不光滑, 细胞突起减少，核质比小，细胞质空间增大，核周隙增大、不规则，异染色质增多、边集,说明细胞处在凋亡之中. 本实验未发现凋亡小体,可能与细胞种类有关. 总之，参与细胞凋亡过程的因子众多，它们组成了一个相互制约、相互影响的，完成细胞凋亡过程的正负凋节. 细胞凋亡的正确施行，对于机体正常代谢、保持自身稳定至关重要. 但是，组织细胞过早或过多地凋亡，会引起组织器官及其功能的早衰,从而导致PD.

　　【】

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Yü RT, Li X, Gao LD, et al. The research of relationship between cellular
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