益气化瘀方及其拆方对大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡相关因子的作用
作者：周泉, 王拥军, 施杞, 孙鹏, 周重建, 胡志俊, 刘梅
【关键词】 ,益气化瘀方
［摘要］ 目的：研究益气化瘀方及其拆方药理血清对大鼠诱导凋亡椎间盘纤维环细胞bcl2、Bax及半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）表达的影响。方法：用细胞免疫化学和积分光密度分析等方法比较分析益气化瘀方及其拆方益气方、化瘀方药理血清，以及胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor 1, IGF1）对抗Fas抗体（antiFas antibody）诱导凋亡大鼠椎间盘纤维环细胞bcl2、Bax及caspase8表达的影响。结果：益气化瘀方、益气方、化瘀方及IGF1血清处理组与凋亡模型组相比，bcl2表达升高，Bax及caspase8表达降低，均有统计学意义（P<0.01）；益气化瘀方组与益气方、化瘀方组比较，Bax表达明显降低，有统计学意义（P<0.05）。结论：益气化瘀方及其拆方可以调控大鼠椎间盘纤维环细胞内Bax、bcl2和caspase8表达，其延缓椎间盘退变的机制可能与调控细胞的凋亡相关因子有关。
［关键词］ 益气化瘀方; 椎间盘; 纤维环细胞; bcl2; Bax; caspase8
Effects of Yiqi Huayu Recipe and its decomposed formulas on apoptosisrelated factors of anulus fibrosus cells in rats
ABSTRACT Objective: To study the effects of Yiqi Huayu Recipe and its decomposed formulasmedicated sera on expressions of bcl2, Bax and caspase8 of apoptotic anulus fibrosus cells in rats. Methods: Immunohistochemical and integral optical density analytic methods were used to observe the effects of Yiqi Huayu Recipe, Yiqi Recipe, Huayu Recipemedicated sera and insulinlike growth factor 1 (IGF1) on the expressions of bcl2, Bax and caspase8 of apoptotic anulus fibrosus cells in rats induced by antiFas antibody. Results: As compared with apoptosis group, bcl2 expression was higher, Bax and caspase8 expressions were lower in Yiqi Huayutreated, Yiqitreated, Huayutreated and IGF1 groups (P<0.01). As compared with Yiqitreated group and Huayutreated group, Bax expression was lower in Yiqi Huayutreated group (P<0.05). Conclusion: Yiqi Huayu Recipe and its decompsed formulas can delay degeneration of the cervical intervertebral disc, which may be due to its action in regulating the expressions of bcl2, Bax and caspase8.
KEY WORDS Yiqi Huayu Recipe; intervertebral disc; anulus fibrosus; bcl2; Bax; caspase8
椎间盘退变主要表现为椎间盘细胞的凋亡和细胞外基质合成与分泌的减少,椎间盘细胞自分泌和旁分泌Fas配体触发凋亡。益气化瘀法是施杞教授根据大量临床和实验研究出来的颈椎病的法则，本研究探讨其对椎间盘细胞凋亡相关因子的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器与材料 达氏修正依氏培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium, DMEM），Gibco公司产品；粗品胶原酶，上海市医药研究院产品；胰蛋白酶，Promega公司产品；小牛血清，杭州四季青生物制剂公司产品；鼠抗人bcl2蛋白单克隆抗体，兔抗人Bax蛋白单克隆抗体，链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物试剂盒，Dako公司产品；兔抗人caspase8蛋白单克隆抗体，Santa Cruz公司产品；CO2培养箱，Heraeus B5060 EKCO2；CSB1超净台，上海净化设备厂产品；倒置显微镜，Olympus公司产品；120目尼龙网筛过滤器、培养瓶，Unclon公司产品；CMIAS99B型医学图像系统，北京航空航天大学图像中心产品；益气化瘀方（黄芪、党参、川芎、丹参，人工麝香），益气方（黄芪、党参），化瘀方（川芎、丹参，人工麝香）［1］。
1.2 细胞培养及分组 1月龄大鼠，无菌手术条件下，取下颈部椎间盘纤维环，采用连续酶消化法分离、培养［2］。细胞生长铺满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代，将Ⅲ代细胞以2×104/ml密度接种于内置玻片的6孔培养板和培养瓶内，培养第5天时，换无血清培养液孵育，24 h后去上清液，加入含1%小牛血清DMEM配制的抗Fas抗体，浓度为0.25 μg/ml，继续培养12 h后，分为6组：正常对照组、凋亡诱导组、中药血清治疗组（益气化瘀方、益气方和化瘀方）［1］、重组人IGF1（R＆D Systems Inc产品，用1％小牛血清配制成终浓度为50 ng/ml）组，再孵育48 h，然后收集细胞进行观察。
1.3 Bax、bcl2和caspase8细胞免疫化学法检测 取纤维环细胞玻片，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3 min，3次；85%、95%和100%乙醇脱水，用中性树脂将盖玻片无细胞面贴在载玻片上，风干；0.3% H2O2室温20 min，PBS洗涤3 min，3次；0.1% Triton×100PBS洗20 min，PBS洗涤3 min，3次；加入一抗；4 ℃冰箱过夜，PBS洗涤3 min，3次；加入二抗为生物素化羊抗兔IgG（1∶400），37 ℃，30 min, PBS洗涤3 min，3次；抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）HRP(1∶400)，37 ℃，40 min，PBS洗涤3 min，3次；0.05%联苯二胺加0.03%H2O2，12 min；苏木素衬染，常规封片。阳性结果判断：染色阳性表达为棕黄色，无着色为阴性。以不加一抗为阴性对照。
1.4 图像分析 取免疫组化染色玻片，200倍光学显微镜下，在上下的基础上，再分左、中、右，共观察6个视野，使用CMIAS99B型医学图像系统，用积分光密度对阳性信号进行量化分析。
1.5 统计学方法 用SPSS 10.0统计软件包，进行单因素方差分析。
2 结果
正常对照组的Bax和caspase8积分光密度低，轻度表达；凋亡诱导组的Bax和caspase8积分光密度高，表达明显，高于正常对照组(P<0.01)；正常对照组的bcl2积分光密度高，bcl2高度表达；凋亡诱导组的bcl2积分光密度低，表达不明显，与正常组比较有统计学意义(P<0.01)。3种中药药理血清及IGF1组和凋亡诱导组比较，Bax和caspase8呈明显的下调，而bcl2呈明显的上调，差异有统计学意义(P<0.01)。益气化瘀方组与益气方、化瘀方组比较，Bax表达明显降低（P<0.05）。见表1。
表 1 bcl2、Bax和caspase8积分光密度结果（略）
Tab 1 Integral optical density results of bcl2, Bax and caspase8
*P<0.05, vs Yiqi Huayutreated group; △P<0.05, △△P<0.01, vs normal control group; ▲▲P<0.01, vs apoptosis group
3 讨论
椎间盘退变是颈椎病发病的主要原因，细胞凋亡是椎间盘退变的主要表现，椎间盘细胞自分泌和旁分泌Fas配体触发的凋亡为其机制之一［3,4］。Fas是一种跨膜蛋白，它与Fas配体（Fas ligand, FasL）结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。椎间盘细胞按来源部位可分为3种：纤维环细胞、髓核细胞和软骨终板细胞。本文纤维环细胞凋亡研究为椎间盘细胞学研究中的部分内容。
中医学认为颈椎病属于“痹症”、“痉证”、“痿证”、“痰饮”、“内伤”、“眩晕”、“头痛”等病证范畴。颈椎病外因包括风寒湿、慢性劳损、咽喉部感染等因素，内因乃正气虚弱、气血失调、脏腑不和。“血行失度，随损伤之处而停积”，所以“时损痛也”；荣养失职，引起了不荣则痛和肢麻等症状。所谓“积劳受损，经脉之气不及贯串”，“血气不和，百病乃变化而生”。施杞教授在“气血兼顾，以气为主，以血为先”理论的基础上，结合颈椎病临床观察和实验研究，提出“益气化瘀、标本兼顾”治疗颈椎病之法则［5］。
Osada等［6］研究证实，在正常的椎间盘与退变的椎间盘中，IGF1 mRNA表达有明显差异。Gruber等［7］发现体外培养椎间盘细胞中加入IGF1和血小板衍生生长因子（plateletderived growth factor, PDGF）有明显抗凋亡作用。因此，本研究选用IGF1作为对照药物。
细胞凋亡的过程实际上是caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。caspase8前体可被Fas的死亡结构域激活［8］，并被募集到Fas和肿瘤坏死因子受体1死亡受体复合物，水解活化，启动caspase活化后，即开启细胞内的死亡程序［9，10］。caspase引起线粒体渗透性转变孔(mitochondria permeability transition pore, MPTP)的打开，导致线粒体的跨膜电位下降，同时细胞色素C被释放到胞质中，凋亡抑制因子bcl2被灭活。bcl2的生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内质网以及核膜上，并通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。bcl2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了caspase的活性。caspase介导细胞凋亡的信号传导，与凋亡效应器细胞色素C、bcl2蛋白家族间相互作用。Bax是bcl2家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，它从胞液迁移到线粒体和核膜，增加线粒体膜的通透性［11］，造成细胞色素C从线粒体膜间隙释放到胞质［12］。抑制Bax基因表达，提高bcl2/Bax比值，有可能会抑制凋亡、促进细胞存活［13，14］。
在椎间盘退变研究中，李小川等［15］发现退变腰椎间盘组织中bcl2蛋白表达越弱，Bax蛋白表达越强，凋亡细胞数越多。认为bcl2和Bax蛋白均参与了腰椎间盘组织中细胞凋亡的调节，并在腰椎间盘退行性变发生和中发挥着重要作用。本课题组前期研究发现益气化瘀方可以增加椎间盘营养供应［16，17］，促进神经元的增生，加快神经肌肉接头的重建，显著缩短神经再生修复的进程［18］，抑制退变椎间盘中炎症介质［19］，上调Ⅱ型胶原mRNA的表达［20］，对椎体骨赘内血清碱性磷酸酶活性［21］和椎间盘中生长因子具有调控作用［22，23］。颈椎间盘退变与椎间盘细胞凋亡有关，芪麝颈康丸（益气化瘀药为主组成）有抑制椎间盘细胞凋亡的可能性［24］。我们使用免疫细胞化学法观察3种中药血清(益气化瘀方、益气方和化瘀方)和IGF1对抗Fas抗体诱导凋亡纤维环细胞Bax、bcl2和caspase8的表达的影响，3种中药药理血清以及IGF1均下调Bax和caspase8，上调bcl2，这说明益气化瘀方可能通过增强bcl2表达而降低了caspase8的活性，阻断了Fas死亡信号的传导和执行，中药血清有生长因子IGF1样作用，这可能是其抑制凋亡的机制所在。益气化瘀方与益气方和化瘀方比较，Bax表达差异有统计学意义，益气化瘀方作用优于拆方。本研究在细胞学水平证实益气化瘀方对纤维环细胞凋亡的影响可能是通过调节凋亡相关因子实现的，提示益气化瘀方延缓椎间盘退变的机制，可能是通过对椎间盘纤维环细胞凋亡的调控而产生。
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