六味地黄丸对OLETF大鼠胰腺凋亡相关基因bcl

              作者：薛耀明，罗仁，朱波，张燕，潘永华，李晨钟

【关键词】  糖尿病

    ［摘要］  目的：探讨六味地黄丸对自发性2型糖尿病大鼠胰腺组织凋亡相关基因bcl2和Bax表达的影响。方法：OLETF大鼠（自发性2型糖尿病）40只，随机分为六味地黄丸组和模型组，每组20只；另同系LETO大鼠（非糖尿病）10只作为正常对照组。六味地黄丸治疗组于大鼠8周龄起，用六味地黄丸按2.4 g・kg1・d1灌胃，余组用等量蒸馏水灌胃。每周记录大鼠体质量；采用口服葡萄糖耐量试验监测血糖；定期处死大鼠，分离胰腺并称重；采用逆转录聚合酶链反应检测bcl2和Bax在胰腺组织中的表达。结果：大鼠40周龄时，六味地黄丸治疗组bcl2 mRNA的表达水平为（1.25±0.07），较模型组（1.01±0.16）明显增高（P<0.01）；Bax mRNA的表达水平为（0.57±0.11），较模型组（1.18±0.28）有明显降低（P<0.01）。六味地黄丸治疗组的胰腺/体重比，较模型组增高，但差异无统计学意义。六味地黄丸治疗组的糖负荷能力明显高于模型组（P<0.05或P<0.01）。结论：六味地黄丸在转录水平可上调bcl2 mRNA的表达，下调Bax mRNA的表达，可能具有抗细胞凋亡的作用。

　　［关键词］  糖尿病, 2型; 凋亡; 基因, bcl2; 基因, Bax; 六味地黄汤; 大鼠, OLETF

　　Effects of Liuwei Dihuang Pills on expressions of apoptosisrelated genes bcl2 and Bax in pancreas of OLETF rats

　　ABSTRACT  Objective: To investigate the effects of Liuwei Dihuang Pills (LWDHP) on expressions of apoptosisrelated genes bcl2 and Bax in pancreas of OLETF rats. Methods: Forty male OLETF rats were randomly divided into LWDHPtreated group and untreated group. Another ten male LETO rats were included in normal control group. OLETF rats in the LWDHPtreated group were given LWDHP (2.4 g・kg1・d1) orally since the age of 8 weeks and the rats in the other two groups were given distilled water orally. Body weights of rats were recorded weekly and blood glucose concentration was determined by oral glucose tolerance  test (OGTT). Pancreas weights were recorded after rats were killed and the expression levels of bcl2 mRNA and Bax mRNA were detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). Results: In the LWDHPtreated group, the expression of bcl2 mRNA in the pancreas of rats at the age of 40 weeks (1.25±0.07) was much higher than that in the untreated group (1.01±0.16), P<0.01. Bax mRNA level in the LWDHPtreated group (0.57±0.11) was obviously lower than that in the untreated group (1.18±0.28), P<0.01. There was no significant difference of pancreastobody weight ratios between the LWDHPtreated group and the untreated group. The ability of glucose tolerance was improved in the LWDHPtreated group. Conclusion: LWDHP can upregulate the expression of bcl2 and downregulate the expression of Bax at transcription level, which maybe contribute to the antiapoptosis effects of LWDHP.

　　KEY WORDS  diabetes mellitus, type 2; apoptosis; gene, bcl2; gene, Bax; Liuwei Dihuang Decoction; rats, OLETF

　　六味地黄丸（Liuwei Dihuang Pills, LWDHP）是中医治疗糖尿病的传统方剂，至今仍在临床上被广泛应用。基础和临床研究都显示，六味地黄丸可明显改善糖尿病发病过程中的葡萄糖代谢异常及胰岛素抵抗［1,2］。胰岛素抵抗和胰岛功能受损是2型糖尿病的两个基本发病环节。β细胞凋亡是导致胰岛功能受损的主要原因［3,4］。但有关六味地黄丸与胰岛细胞凋亡的研究尚未见报道。本实验以自发性糖尿病动物模型OLETF（Otsuka longevans Tokushima fatty）大鼠及其同系非糖尿病LETO（Longevans Tokushima Otsuka）大鼠为研究对象，进行36周的实验观察，探讨了六味地黄丸对凋亡相关基因bcl2和Bax在大鼠胰腺组织中表达的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物和分组  4周龄雄性OLETF大鼠40只和LETO鼠10只（日本大冢制药株式会社德岛研究所提供）。OLETF大鼠随机分为2组，即六味地黄丸治疗组和模型组，每组10只。同系非糖尿病LETO大鼠10只作为正常对照组。

　　1.2  实验药物和仪器  六味地黄浓缩丸，北京同仁堂制药厂产品；稳豪血糖仪及血糖试纸，美国强生公司产品；bcl2，Bax和3磷酸甘油醛脱氢酶（glyseraldehyde3phosphate dehydrogenase, GAPDH）引物由上海博亚生物技术公司合成。

　　1.3  动物饲养方法  所有大鼠均在无特定病原体条件下单笼饲养，予以标准饲料喂养，自由取食和饮水。环境温度22～25 ℃，每12 h光照与黑暗循环交替。

　　1.4  给药方法  六味地黄丸加入蒸馏水，搅拌加热后弃去沉渣，留汤液灌胃，浓度为0.6～0.8 g/ml，按2.4 g・kg1・d1灌胃，1 d/次；模型组与正常对照组用等量蒸馏水灌胃，1 d/次。

　　1.5  口服葡萄糖耐量试验  实验前禁食15 h，不禁水，按2 g/kg予以30%葡萄糖溶液灌胃。采用剪尾法，于空腹时及糖负荷后30、60、90、120 min时采血测血糖值（强生稳豪血糖仪）。

　　1.6  葡萄糖曲线下面积（area under the curve, AUC）  葡萄糖AUC＝（空腹血糖值＋餐后2 h血糖值）/2＋餐后0.5 h血糖值＋餐后1 h血糖值＋餐后1.5 h血糖值

　　1.7  标本采集及指标检测  每周称量大鼠体质量。于8、32和40周龄时分批处死大鼠，用3%戊巴比妥钠按1 ml/kg予以麻醉，剖腹，分离胰腺，用滤纸吸干水分后称重，置于液氮中保存，待检。取胰腺组织20 mg，用TRIzol Reagent提取总RNA，在20 μl反应体系中进行逆转录反应。反应产物用于聚合酶链反应扩增。bcl2退火温度58 ℃，34个循环，上游引物：5’ GCTACGAGTGGGATACTGGAG 3’，下游引物：5’ GACAGCCAGGAGAAATCAAAC 3’，扩增片段长度559 bp；Bax退火温度52 ℃，32个循环，上游引物：5’ CATCCAGGATCGAGCAGAGAG 3’，下游引物5’ AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC 3’，扩增片段长度为262 bp；内参照GAPDH退火温度58 ℃，34个循环，上游引物：5’ CCTTCATTGACCTCAACTACATGG 3’，下游引物：5’ GCAGTGATGGCATGGACTGTG GT 3’，扩增片段长度442 bp。反应产物琼脂糖凝胶电泳观察，UVIband凝胶图像分析系统分析电泳结果。

　　1.8  统计学方法  采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，组间比较采用方差分析，计数资料组间率比较采用χ2检验。

　　2  结果

　　2.1  六味地黄丸对OLETF大鼠血糖的影响  六味地黄丸组2 h餐后血糖（postprandial blood glucose, PBG）在大鼠40周龄为（12.0±3.0）mmol/L，较模型组（14.8±3.2）mmol/L明显降低（P<0.01）。六味地黄丸治疗组AUC自大鼠30周龄开始，较模型组逐步降低（P<0.05）。六味地黄丸治疗组和模型组的AUC始终明显高于正常对照组（P<0.01）。见表1。

　　2.2  六味地黄丸对胰腺/体重比的影响  大鼠32周龄前，各组大鼠胰腺/体重比的比较无明显差异。大鼠40周龄时，六味地黄丸治疗组和模型组的胰腺/体重比较正常对照组大鼠明显升高（P<0.01）。六味地黄丸治疗组胰腺/体重比在32、40周龄时均高于模型组，但差异无统计学意义。见表2。

　　表1  3组大鼠血糖值及AUC（略）

　　Tab 1  Blood glucose concentration and AUC of rats in 3 groups

　　*P<0.05, **P<0.01 vs untreated group at age of the same weeks; △△P<0.01 vs normal control group at age of the same weeks

　　表2  3组大鼠胰腺/体重比（略）

　　Tab 2  Pancreastobody weight ratio of rats in 3 groups

　　**P<0.01 vs normal control group at age of the same weeks

　　2.3  六味地黄丸对bcl2和Bax基因表达的影响  各组大鼠bcl2 mRNA表达水平均随周龄增加而降低，但这种变化无统计学差异。大鼠32周龄时，正常对照组bcl2 mRNA表达水平最高，六味地黄丸治疗组次之，模型组最低，但差异不具有统计学意义。大鼠40周龄时，模型组大鼠bcl2 mRNA表达水平明显低于六味地黄丸治疗组和正常对照组（P<0.01），而六味地黄丸治疗组与正常对照组bcl2 mRNA表达水平的比较则无统计学差异。各组大鼠Bax mRNA表达水平均随周龄增加而升高，但同组内不同周龄间的比较无统计学差异。大鼠8周龄时，正常对照组Bax mRNA表达水平与模型组比较，亦无统计学差异。大鼠32、40周龄时，六味地黄丸治疗组和正常对照组Bax mRNA表达水平均明显低于模型组（P<0.01），而六味地黄丸治疗组与正常对照组之间的比较则无统计学差异。见表3。

　　表3  3组大鼠bcl2和Bax mRNA表达水平（略）

　　Tab 2  Expression levels of bcl2　and Bax mRNAs of rats in 3 groups

　　**P<0.01 vs untreated group at age of the same weeks

　　3  讨论

　　六味地黄丸具有降低糖尿病动物血糖、血脂、游离脂肪酸［1,2］、抗氧化及清除自由基的作用［5］。大量研究表明，糖、脂代谢紊乱，尤其是氧化应激与胰岛β细胞的凋亡有着密切的关系［6］。本实验从凋亡相关基因表达的角度探讨了六味地黄丸对胰岛β细胞凋亡的作用。

　　实验发现，经六味地黄丸干预的大鼠，其糖负荷能力较模型组明显改善，无论是负荷后2 h血糖还是AUC，六味地黄丸治疗组都明显低于模型组，表明六味地黄丸可推迟糖调节功能受损出现的时间，具有改善糖代谢的能力。实验中，OLETF大鼠空腹血糖随病程进展无明显变化，此为OLETF大鼠的生理特点，与国外同类研究报道一致［7］。

　　胰岛中绝大部分是具有分泌胰岛素能力的胰岛β细胞。凋亡是胰岛β细胞死亡的主要形式，β细胞数量的减少可能是导致2型糖尿病β细胞功能障碍的主要原因［3］。减少凋亡对于维持胰岛β细胞功能具有重要的意义。本实验中，六味地黄丸治疗组大鼠胰腺/体重比与模型组比较，有增高的趋势，这可能是六味地黄丸调节凋亡相关基因，从而保护胰岛的一个表现。

　　六味地黄丸能明显上调OLETF大鼠胰腺中bcl2基因在转录水平的表达，下调Bax基因的表达。bcl2和Bax都属于bcl2超家族的成员，是细胞凋亡途径中一组重要的调节基因。bcl2能抑制细胞凋亡，为凋亡抑制相关基因；Bax有促进凋亡的作用，为凋亡促进相关基因。两者及其家族其他成员共同构成了一个复杂的相互作用的，精细地调控着细胞凋亡。本实验结果提示，六味地黄丸可能通过上调bcl2的表达，同时抑制Bax的表达，从而发挥抑制胰岛β细胞凋亡的作用。六味地黄丸对于凋亡相关基因影响的机制目前尚不清楚，可能与其改善胰岛素抵抗，降低血脂、游离脂肪酸产生的脂毒性及抑制氧化应激有关。但也可能存在对凋亡调节基因直接的调控作用，尚需进一步的实验证实。

　　［］

　　1  张汝学, 周金黄, 张永祥, 等. 去胸腺对大鼠糖代谢的影响及地黄寡糖对其的调节作用［J］. 药通报, 2002, 18(2): 194197.

　　2  王  敏. 六味地黄丸合用消渴丸对糖尿病大鼠血糖及血脂代谢的实验研究［J］. 中华实用中西医杂志, 2003, 3(16): 10861088.

　　3  Butler AE, Janson J, BonnerWeir S, et al. Betacell deficit and increased betacell apoptosis in humans with type 2 diabetes［J］. Diabetes, 2003, 52(1): 102110.

　　4  Butler AE, Janson J, Ritzel R, et al. Accelerated apoptosis overcomes increased replication to cause βcell loss in diabetes in mice transgenic for hIAPP［J］. Diabetes, 2002, 51 (Suppl 2): A7.

　　5  胡合营, 郑军萍. 糖尿病患者血中SOD含量变化与维生素E、六味地黄丸关系的临床观察［J］. 放射免疫学杂志, 2001, 14(3): 140141.

　　6  Maechler P, Jornot L, Wollheim CB. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells［J］. J Biol Chem, 1999, 274(39): 2790527913.

　　7  Kawano K, Hirashima T, Mori S, et al. Spontaneous longterm hyperglycemic rat with diabetic complications. Otsuka LongEvans Tokushima Fatty (OLETF) strain［J］. Diabetes, 1992, 41(11): 14221428.