人参茎叶皂苷对热损伤大鼠不同脏器糖皮质激素受体的影响

【关键词】  人参皂苷

    ［摘要］  目的：观察人参茎叶皂苷（ginsenosides, GSS）对热损伤大鼠不同脏器糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）的影响，并探讨其作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为：（1）正常对照组，室温下饲养，蒸馏水灌胃；（2）GSS组，室温下饲养，GSS灌胃；（3）热损伤模型组，蒸馏水灌胃，制作热损伤模型；（4）热损伤模型GSS治疗组，GSS灌胃，制作热损伤模型。采用放射配体结合法检测大鼠脑、胸腺、肺和肝细胞液GR结合活性；逆转录聚合酶链反应法测定脑、肝细胞液GR mRNA的水平；放射免疫法测定血浆促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropin, ACTH）和皮质酮（corticosterone, CS）的浓度。结果：热损伤模型GSS治疗组大鼠脑、肺和肝细胞液GR结合活性以及脑和肝细胞液GR mRNA表达水平均明显高于单纯热损伤模型组（P＜0.05或P＜0.01）；热损伤模型GSS治疗组大鼠血浆ACTH和CS浓度与单纯热损伤模型组比较则无明显差异。结论：GSS可缓解热损伤大鼠不同脏器GR结合活性的下降幅度，其作用机制可能与促进GR mRNA的表达有关。

　　［关键词］  人参皂苷; 人参茎叶; 糖皮质激素受体; 热损伤; 大鼠

　　Effects of ginsenosides extracted from ginseng stem and leaves on glucocorticoid receptor in different viscera in heatdamaged rats

　　ABSTRACT  Objective: To evaluate the effects of ginsenosides (GSS) extracted from ginseng stem and leaves on glucocorticoid receptor (GR) in different viscera in heatdamaged rats, and to find out its action mechanism. Methods: Thirtytwo male SD rats were divided into control group and experimental group, and fed 2 mg/d GSS and equalquantity of distilled water respectively for 7 days. Eight rats of each group were exposed to (42±1)℃ for one hour. The binding activities of GR in brain, thymus, lung and liver cytosols in rats were detected by radioligand binding assay. The expression levels of GR mRNA in brain and liver cytosols were determined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) assay. Plasma adrenocorticotropin (ACTH) and corticosterone (CS) concentrations were determined by radioimmunoassay. Results: The binding activities of GR in brain, lung and liver cytosols, and the expression levels of GR mRNA in brain and liver cytosols were all higher in the GSStreated and heatdamaged rats than those in the untreated heatdamaged rats (P＜0.05 or P＜0.01). There were no significant differences in plasma concentrations of ACTH and CS between the GSStreated heatdamaged rats and the untreated heatdamaged rats. Conclusion: GSS can lessen the descending degree of the binding activity of GR in brain, thymus, lung and liver cytosols, and such efficacy of GSS may be related to improvment of the expression of GR mRNA.

　　KEY WORDS  ginsenosides; ginseng stem and leaves; glucocorticoid receptor; heat damage; rat

　　以往研究发现，热损伤大鼠肝细胞糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）的结合活性明显下降，而人参茎叶皂苷（ginsenosides, GSS）对其有一定的保护作用［1］。但未见有关热损伤大鼠其他脏器细胞GR功能的变化以及GSS是否对其有调节作用的报道。本实验观察了GSS对热损伤大鼠脑、胸腺、肺和肝细胞液GR结合活性的影响，并探讨其作用机制，现将结果报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  药物  人参茎叶皂苷由黑龙江东宁制药厂提供，纯度91.67%，用蒸馏水配制成10 mg/ml水溶液备用。

　　1.2  动物分组和模型制作  SD雄性大鼠（购自上海西普尔必凯实验动物有限公司）32只，体质量（175±3.6）g，室温（22±1）℃环境适应3 d后随机分为4组：（1）正常对照组8只，室温下饲养，蒸馏水灌胃；（2）GSS治疗组8只，室温下饲养，GSS灌胃；（3）热损伤模型组8只，蒸馏水灌胃，制作热损伤模型；（4）热损伤模型GSS治疗组8只，GSS灌胃，制作热损伤模型。各组大鼠灌胃剂量2 ml/次，1次/d，连续7 d。

　　热损伤模型制作：于末次灌胃30 min后将大鼠放入（42±1）℃、相对湿度80%的恒温箱中热暴露1 h，测肛温（41±0.5）℃，耳、爪、尾等暴露部位潮红，大量流涎，呼吸急促，四肢伸展，呈昏睡状态，表明大鼠已处于热损伤阶段。

　　1.3  动物处死  为避免昼夜节律对激素分泌及其受体的影响，各组动物均于统一时间完成实验程序后快速断头处死，取所需组织备用。

　　1.4  指标测定  采用放射免疫法测定血浆促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropin, ACTH）和皮质酮（corticosterone, CS）的浓度。采用单点分析法测定脑、肺和肝细胞液GR最大结合容量。因胸腺细胞较少，故采用单点分析法测定胸腺淋巴细胞GR特异性结合位点。采用逆转录聚合酶链反应法测定脑、肝细胞液GR mRNA的水平，用一步法抽提总RNA。RT，4 μl 5× First Strand Buffer（美国Gibco BRL公司产品），0.5 μl RNase Inhibitor（美国Promega公司产品），2 μl 100 mmol/L二硫苏糖醇（DLdithiothreitol, DTT）（美国Gibco BRL公司产品），2 μl 4×dNTP mix（上海博彩生物科技有限公司产品），1 μl 200 U MMLV Reverse Transcriptase（美国Gibco BRL公司产品），37 ℃保温60 min。90 ℃处理5 min，冰上冷却，室温离心将溶液收集至管底。PCR扩增，引物由上海博彩生物科技有限公司合成，上游5’ AGG CCG GTC AGT GTT TTC TA 3’，下游5’ AGG GGT GAG CTG TGG TAA TG 3’，扩增得GR mRNA长度433 bp，每个反应用2.5 μl 10×PCR buffer（w/20 mmol/L MgCl2），19.25 μl H2O，0.5 μl 10 mmol/L 4×dNTP mix，0.25 μl iNosUP，0.25 μl iNosDown，0.25 μl Taq DNA聚合酶（1.25 U，上海博彩生物科技有限公司产品），分装至0.2 ml PCR薄壁管里，每管23 μl。内参βactin 用同样方式进行。每管加2 μl RT产物，加30 μl石蜡油。PCR 扩增条件：94 ℃ 45 s，预变性120 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，循环35次，最后延伸300 s。DNA扩增产物用1.6%琼脂糖电泳和溴乙锭（ethidium bromide, EB）染色后，Tasnon GIS100数码凝胶图像分析系统进行扩增结果检测和半定量分析。

　　1.5  统计学方法  所有实验数据均用SPSS 11.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，组间比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  GSS对热损伤大鼠脑、胸腺、肺和肝细胞液GR结合活性的影响  经热暴露1 h，大鼠脑、胸腺、肺和肝细胞液GR结合活性急剧下降，而GSS可不同程度缓解热暴露时GR结合活性的下降幅度。见表1。

　　2.2  GSS对热损伤大鼠脑、肝细胞液GR mRNA水平的影响  经热暴露1 h，大鼠脑、肝细胞液GR mRNA的表达受到了明显抑制，而GSS可以缓解这种抑制作用。见图1、表2。

　　2.3  GSS对热损伤大鼠血浆ACTH和CS含量的影响  急性热暴露使大鼠血浆ACTH和CS含量明显上升，而GSS与蒸馏水灌胃大鼠血浆ACTH和CS含量的比较无明显差异。见表3。

　　表1  GSS对热损伤大鼠脑、胸腺、肺和肝细胞液GR结合活性的影响（略）