锦红片对胆管炎大鼠胸腺的影响
作者：张静 章学林 高炬 沈平 朱培庭
【摘要】 探讨急性胆管炎状态下细胞免疫中枢胸腺的变化以及中药锦红片的干预作用。方法:雄性清洁级SD大鼠24只，随机分为3组，每组8只。胆总管单纯结扎组（简称单纯结扎组）:结扎胆总管，但不注射细菌，手术后喂生理盐水;模型组:建立大鼠急性胆管炎模型，造模手术后喂生理盐水;锦红片组:造模手术后喂锦红片悬液。手术后5 d处死大鼠，胸腺取材，做胸腺电镜和光镜形态学观察，并检测胸腺质量、胸腺指数、凋亡指数、胸腺Bcl-2基因编码蛋白表达和胸腺Fas基因编码蛋白的表达。结果:形态学上凋亡细胞出现频率由高到低依次为模型组、锦红片治疗组和单纯结扎组。模型组胸腺质量和胸腺指数均降低，与锦红片治疗组和单纯结扎组相比，差异有统计学意义。模型组胸腺凋亡指数明显高于锦红片治疗组和单纯结扎组。锦红片治疗组Bcl-2基因编码蛋白表达高于模型组，Fas基因编码蛋白表达组间差异无统计学意义。结论:急性胆管炎时大鼠胸腺质量、胸腺指数降低，胸腺凋亡指数升高，非生理性凋亡增加。清热通下中药锦红片有一定的抑制这种非生理性凋亡的作用，这种作用可能是通过上调凋亡抑制基因Bcl-2编码蛋白的表达实现的。
【关键词】 胸腺; 胆管炎; 清热; 通下; 锦红片
胸腺是机体的细胞免疫中枢，未成熟的T淋巴细胞通过在胸腺内的分化、发育，成熟后释放入血，以维持外周T淋巴细胞池的衡定［1］。凋亡是胸腺细胞维持外周T淋巴细胞质和量的主要方式，其过程受到严格调控［2］。以往鲜有急性胆管炎与胸腺细胞凋亡方面的报道，而我们在过去的实验中发现，治疗急性胆道感染方面疗效显著的清热通下中药锦红片对胆管炎动物外周免疫反应有调控作用［3～5］。为了解中药锦红片在治疗急性胆管炎中对细胞免疫中枢胸腺的影响，我们进行了以下实验研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料 清洁级SD大鼠，雄性，10周龄，体质量160～180 g，由上海中医药大学实验动物中心提供。LIBROR AEL-160天平，日本岛津公司产品;AHBT-5B显微镜，Olympus公司产品;TEM-1200透射电镜，日本日立公司产品;石腊切片机，日本Aiwa公司产品;缺口末端标记法（Tdt-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling， TUNEL）试剂盒，Boehringer Mannheim公司产品;Bcl-2单克隆抗体（兔抗鼠IgG）和Fas单克隆抗体（兔抗鼠IgG），Gene公司产品;免疫组化试剂盒，福州迈新生物技术公司产品;蛋白酶K、DNA酶和二氨基联苯胺（diaminobenzidine， DAB），Sigma公司产品。
1.2 实验方法 动物领来后放入实验场所3 d以适应环境，造模前禁食8 h，禁水4 h。参照龚建平等［6］的造模方法，将实验大鼠胆总管结扎，同时向胆总管内注入致病性大肠杆菌，建立大鼠急性胆道感染模型。
1.3 实验分组 24只SD大鼠随机分为3组，每组8只。胆总管单纯结扎组（简称单纯结扎组）:结扎胆总管，但不注射细菌，手术后喂以生理盐水。模型组:造模手术后喂以生理盐水。锦红片治疗组:造模手术后喂锦红片悬液，由上海中药制药一厂提供锦红片干粉，以蒸馏水配成含干粉110 mg/ml的悬混液，按10 ml/kg体质量灌胃，2次/d。于手术后第 5天 处死大鼠，胸腺取材。
1.4 检测指标
1.4.1 胸腺质量和胸腺指数 完整取出胸腺后，电子天平称取胸腺质量，胸腺指数。胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）
1.4.2 光镜观察 胸腺组织以中性福尔马林固定， 常规脱水，包埋，切片，脱腊至水，HE染色。
1.4.3 电镜观察 取约1 mm×2 mm的胸腺组织，用2.5%戊二醛固定，梯度脱水，包埋，超薄切片，醋酸铅染色，透射电镜下观察。
1.4.4 Bcl-2基因编码蛋白免疫组化 2 μm石腊切片，脱腊至水，3% H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，用微波热修复抗原，PBS浸泡5 min，5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min;倾去血清，滴加1∶200 Bcl-2单抗100 μl，37 ℃孵育60 min或4 ℃过夜;PBS冲洗3次，5 min/次;滴加适当比例的生物素标记二抗100 μl，37 ℃孵育10～30 min;PBS冲洗 3次， 5 min/次;滴加适当比例稀释的抗生物素辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37 ℃孵育10～ 30 min; PBS冲洗3次，5 min/次，加DAB显色;自来水充分冲洗，复染，封片。同时设立阴性对照，以正常兔血清代替一抗。
1.4.5 Fas基因编码蛋白免疫组化 步骤基本同上，Fas单抗工作浓度为1∶150。
1.4.6 TUNEL检测 按原位细胞凋亡检测试剂盒说明操作，即以生物素化脱氧三磷酸尿苷（deoxy-uridine triphosphate， dUTP）标记DNA片段钝端，再用免疫组化法放大标记信号，用DAB显色，苏木素衬染。
1.4.7 切片分析 对TUNEL检测、Bcl-2及Fas表达分析，在不告知动物分组信息的前提下，分别送复旦大学医学院和上海大学医学院作阅读分析并出具报告。
1.5 统计学方法 胸腺质量、胸腺指数、凋亡指数等用 x ±s表示，数据用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。免疫组化数据用χ2检验。
2 结果
2.1各组胸腺质量和胸腺指数 模型组胸腺质量和胸腺指数均降低，而锦红片治疗组均升高。见表1。
2.2 TUNEL检测 高倍镜下随机计算各组每份标本上、下、左、中、右5个视野的凋亡指数。凋亡指数（%）=（阳性细胞数/细胞总数）×100。经TUNEL标记后，光镜下凋亡细胞的核呈深棕色，标记阳性细胞着色多位于细胞核周边，核中央反应不明显，细胞结构仍较完好。见表2、图1。
表1 各组胸腺质量和胸腺指数（略）
Table 1 The weight and index of thymus in three groups
*P <0.05，**P <0.01， vs untreated group.
表2 各组胸腺凋亡指数（略）
Table 2 The index of apoptosis of thymus in three groups
*P <0.05，**P <0.01， vs untreated group.
2.3 Bcl-2和Fas表达分析 Bcl-2阳性细胞着色多位于胞浆及胞膜。锦红片治疗组胸腺Bcl-2基因编码蛋白表达与模型组相比，差异有统计学意义（ P <0.01 ）。Fas阳性细胞着色多位于胞浆、胞膜，部分位于胞膜外。根据细胞有无着色、着色深浅及 着色细胞的比例拟定半定量评分。A项按显色有无及显色深浅计分:0分为不着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;B项按显色细胞的比例评分:1分为1%～10%，2分为11%～30%，3分为31%～50%，4分为51%以上。每例总积分=A×B，总积分0分为（ ），1～3分为（+），3～6分为（++），6分以上为（+++）。各组Bcl-2和Fas表达均检测8份标本，每张切片高倍镜下随机取上、下、左、中、右5个视野计数。结果见表3。
2.4 光镜观察 模型组胸腺皮质变薄，有少量炎性细胞浸润，胸腺细胞密度降低，有少量点状坏死灶;锦红片治疗组胸腺皮质较模型组厚，同单纯结扎组基本相同，有少量炎性细胞浸润，胸腺细胞数较模型组多，未见明显坏死灶。
2.5 电镜观察 各组胸腺细胞结构基本相同，模型组胸腺中有较多巨噬细胞，可见大量典型的凋亡细胞，特征为染色质浓缩、边聚、核膜皱缩，微绒毛消失，凋亡小体形成，部分呈新月形，细胞膜完整，细胞器存在，可见凋亡小体被邻近细胞及巨噬细胞吞噬现象。与TUNEL检测到的胸腺凋亡指数结果相似，电镜观察到胸腺中的凋亡细胞比例以模型组最高，锦红片治疗组次之，单纯结扎组最低。见图2。
图1 各组胸腺组织TUNEL阳性（×400）（略）
Figure 1 TUNEL positive thymus in three groups （×400）
A: Ligation group; B: Untreated group; C: Jinhong Tablet-treated group.
图2 各组透射电镜下胸腺细胞超微结构（×5 000）（略）
Figure 2 The structure of thymocyte in three groups under electron transmission microscopy （×5 000）
A: Ligation group; B: Untreated group; C: Jinhong Tablet-treated group
表3 胸腺Bcl-2和Fas基因编码蛋白表达（略）
Table 3 Expressions of Bcl-2 and Fas gene coding proteins
3 讨论
胸腺是T淋巴细胞成熟的场所，胸腺细胞成熟过程中，某些细胞克隆的清除、选择，都涉及到凋亡机制，识别自身抗原的自身反应T淋巴细胞在胸腺发育成熟后，甚至在发育过程中就经凋亡途径被清除。细胞数目的动态观察表明，胸腺是一个大量产生短命细胞的场所，大多数胸腺淋巴细胞未发育成熟即已凋亡［7，8］。脂多糖静脉注射能引起胸腺细胞凋亡，并且伴有血浆肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）含量升高，而抗TNF-α抗体可抑制引起的胸腺细胞DNA的片段化;IL-1、IL-2可分别抑制T细胞受体介导的未成熟胸腺细胞的凋亡和糖皮质激素介导的T淋巴细胞的凋亡［9～11］。细胞凋亡的基因调控机制是近年研究的热点，根据作用的不同，可将与细胞凋亡有关的基因分为凋亡促进基因（称自杀基因）和凋亡抑制基因（或称生存基因）。Bcl-2是公认的生存基因，Fas则属于自杀基因。凋亡活动是若干相关基因共同作用完成的，不可能是单一基因表达的结果［12，13］。通过凋亡过程死亡的胸腺皮质细胞绝大多数不能表达Bcl-2，Bcl-2表达参与T细胞的保留;Fas与胸腺细胞的发育有关，Fas系统与Bcl-2的相互作用决定了胸腺细胞的发育过程［14，15］。急性梗阻性胆管炎宿主胸腺细胞凋亡情况的变化鲜有报道。有资料显示TNF-α、内毒素体内外均可诱导胸腺细胞凋亡［16，17］。本研究同期进行的相关生化等实验结果表明，模型组血浆内毒素、TNF-α、IL-6、IL-8等增高，因此推测急性梗阻性胆管炎宿主胸腺细胞凋亡增多。本研究发现，与胆总管单纯结扎组比较，模型组胸腺质量明显降低，胸腺指数降低（ P <0.01），胸腺皮质变薄，胸腺细胞密度降低，凋亡指数增高（ P <0.05），并出现大量典型的凋亡小体，提示模型组胸腺细胞凋亡明显增加，虽然镜下观察到模型组胸腺有少量点状坏死灶，但这不应成为胸腺质量减轻的主要原因。结合同期其他的实验结果，推测外周血中CD3、CD4淋巴细胞减少是细胞免疫中枢胸腺细胞凋亡增多，导致效应细胞减少所致。 锦红片组胸腺质量及胸腺指数明显高于模型组，表明中药治疗后胸腺受损程度明显减轻，有保护胸腺的作用。并且锦红片治疗组胸腺凋亡指数明显低于模型组，可以认为，锦红片能抑制胸腺细胞的过度凋亡，以此维持机体细胞免疫功能的相对稳定。中药抑制胸腺细胞的凋亡可能与其诱导内毒素耐受有关。有报道称反复多次注射小剂量内毒素的动物其胸腺质量、胸腺指数及胸腺活细胞数均明显高于一次注射大剂量内毒素，而梯状DNA则减少，并且，随注射内毒素量的增加，对胸腺的保护作用越强［1］。同期的研究中锦红片治疗组血浆内毒素明显低于模型组，实际起到了诱导内毒素耐受、保护胸腺的作用。本研究锦红片治疗组Bcl-2基因编码蛋白表达多于模型组，而且细胞凋亡也较少，Fas基因编码蛋白表达组间无明显差异，推测具有清热通下作用的中药锦红片可能是通过促进Bcl-2基因编码蛋白的表达而在一定程度上抑制了细胞凋亡。
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