黄芪多糖对3T3?L1前脂肪细胞增殖和分化的影响
作者：刘毅, 王文健, 陈伟华, 应健
【关键词】 黄芪多糖; 增殖; 分化; mRNA; 前脂肪细胞
近年来许多研究表明，黄芪及其主要成分黄芪多糖（Astragalus polysaccharides, APS）可以调节糖脂代谢，具有改善胰岛素抵抗的作用，因此广泛运用于2型糖尿病、肥胖和代谢综合征等代谢相关性疾病的防治［1~4］。在以往的实验中，我们发现黄芪多糖可增加脂肪细胞葡萄糖的摄取和利用，促进前脂肪细胞的分化［3］，为了进一步探讨其影响前脂肪细胞增殖和分化的机制，本研究从影响脂肪细胞分化的两个主要基因过氧化物体增殖剂活化受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ）和CAAT/增强子结合蛋白α（CAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα）mRNA与蛋白质水平，观察了APS对其的影响。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 3T3?L1前脂肪细胞株， American Type Culture Collection（ATCC）产品；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM）、特级新生小牛血清、胎牛血清，Gibco公司产品；胰蛋白酶、青霉素G钠盐、硫酸链霉素、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）和溴化乙啶，Amresco公司产品；APS由复旦大学内分泌研究所提供；胰岛素、地塞米松、异丁基?3甲基?黄嘌呤、二甲氧唑黄｛2,3?bis(2?methoxy?4?nitro?5?sulfophenyl)?5 ?［(phenylamino)carbo?nyl］?2H?tetrazolium hydroxide, XTT｝、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、酶标二抗，Sigma公司产品；罗格列酮（rosiglitazone, ROS），浙江天马医药化工有限公司产品；Trizol试剂，Invitrogen公司产品；硝酸纤维素膜，Whatman公司产品；PPARγ和C/EBPα抗体，Adipogen公司产品；Access Real?time PCR System，Fermentas公司产品；BIO RAD Icycler 5色荧光定量PCR仪、紫外凝胶摄像分析仪和图像分析软件，Sygene Gene Genius公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 3T3?L1前脂肪细胞的培养和诱导分化 将3T3?L1前脂肪细胞用含10%小牛血清的高糖DMEM，在37 ℃、5% CO2的条件下培养，细胞状态良好时接种于培养板，待细胞生长至融合2 d后，加含0.5 mmol/L异丁基?3?甲基黄嘌呤、0.25 μmol/L地塞米松、10 μg/ml胰岛素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养48 h，换以含10 μg/ml胰岛素的培养液再培养48 h，随后以含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养，每隔2 d换1次培养液，诱导分化8～12 d的3T3?L1细胞85%以上呈脂肪细胞表型，可用于实验。
1.2.2 XTT法检测APS对3T3?L1前脂肪细胞增殖的影响 将3T3?L1前脂肪细胞按照不同的细胞浓度接种于96孔板，通过XTT法测定570 nm波长的吸光度值（OD570值），建立“OD570值?细胞数目”曲线。然后再按1.5×104/ml 3T3?L1前脂肪细胞的浓度接种96孔板，每孔100 μl培养基，细胞贴壁后分别加不同浓度的APS（0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L）干预培养，通过XTT法分别检测各组的OD570值，通过“OD570值?细胞数目”曲线出加药24、48和72 h时的细胞数目。
1.2.3 3T3?L1前脂肪细胞分化的定量检测 将3T3?L1前脂肪细胞按上述方法诱导分化。设置空白对照组（normal control, CON组）、黄芪多糖干预组（APS组）及罗格列酮干预组（ROS组），在培养液中分别加入不同的干预药物。APS为0.4 g/L，ROS为10 μmol/L，CON组加等体积生理盐水。在加分化液同时加药，药物与培养液同步更换。分化第8天进行油红O染色，拍摄照片。异丙醇处理已染色的细胞，裂解细胞后通过酶标仪对脂滴着色程度进行比色，570 nm波长检测OD值，定量分析细胞的分化程度。
1.2.4 APS对脂肪细胞PPARγ和C/EBPαmRNA表达的影响 在12孔培养板中，前脂肪细胞的分化培养和药物干预分组同前，在分化第8天时弃培养上清，收集细胞备用，实时聚合酶链式反应检测PPARγ和C/EBPα mRNA的表达。参照Trizol Reagent试剂盒抽提取各组细胞总RNA，取1 μl RNA样本加99 μl超纯水，在紫外分光光度计上比色进行RNA定量，用A260和A280的比值确定RNA的纯度，所有RNA样品A260/A280在1.7～1.9之间。PPARγ上游引物5?’GACCACTCGCATTCCTTT?3’，下游引物5’?CCACAGACTCGGCACTCA?3’，PCR产物266 bp；C/EBPα上游引物5'?GGAAAGAAACGACTGGGAGC?3'，下游引物5'?CGACTAGACGCTATTGTG?ATT?3’，PCR产物214 bp；GAPDH上游引物5’?AAGGTCGGAGTCAACGGATT?3’，下游引物5’?CTGGAAGATGGTGATGGGATT?3’，PCR产物222 bp。以上引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。RNA的反转录：以AMV第一链cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。各样本取1 μg的RNA，加Oligo?dT 1.0 μl，再加DEPC水至体积为12 μl，置70 ℃ 5 min后，再加入5×RT buffer 4 μl、RNasin 1.0 μl、dNTP 2 μl后混匀，置37 ℃ 5 min后，再加入M?MLV 1.0 μl，总体积为20 μl，置42 ℃ 60 min后，再置70 ℃ 10 min，冰上终止反应，cDNA即合成。PCR反应：5×RT?PCR buffer 5.0 μl，250 mmol/L MgCl2 0.3 μl，10 mmol/L dNTP 0.75 μl，10 μmol/L引物1.0 μl，25×SYBR GreenⅠ 1.0 μl，10?3×Calibration 1.0 μl，5 U/μl HS Ex?Taq 酶0.25 μl，模板1.0 μl，DEPC H2O补足25 μl。扩增条件：95 ℃预变性3 min，之后95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，扩增75个循环。反应结束后，使用Sequence Detection System 软件分析PCR过程各检测样本的域值循环数（threshold cycle, CT）值，CT值随模板浓度增大而减小，故荧光实时定量PCR结果显示的CT值恰好和mRNA表达水平相反，通过2?ΔCT计算，将统计数据转化成线性形式后进行统计学处理。
1.2.5 APS对前脂肪细胞PPARγ和C/EBPα蛋白表达的影响 在6孔培养板中，前脂肪细胞的分化培养和药物干预分组同前，在分化第8天收集细胞采用免疫印迹（Western blotting）法检测PPARγ和C/EBPα蛋白表达。具体方法：弃细胞培养液，加入4 ℃预冷的PBS轻轻洗涤细胞两次，再在每孔加入200 μl的细胞总蛋白抽提液，置冰上待细胞样品完全破碎后，转入Eppendorf管中，2 ℃ 13 000 r/min，高速离心20 min，取上清，然后加入同样数量的样品缓冲液备用。在紫外分光光度计下以A280波长测定标准和样本蛋白的OD值，根据标准曲线计算各样品蛋白浓度。配制浓缩胶和分离胶，110 V恒压电压下SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳60 min，电泳完成后取出积层胶，以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30 min，然后再用转移槽转印蛋白质，在冷却条件下100 V电转120 min。转印后蛋白质的可逆染色，用抗体偶联物进行免疫检测，依次加入一抗和二抗，洗膜，化学法发光底物显迹，胶片进行显影，定影，冲洗胶片，图像扫描并分析各条带的光密度，分别计算PPARγ和C/EBPα与内参β?actin的比值。
1.3 统计学方法 采用SAS统计软件处理，数据以x±s表示，多组比较用方差分析，两组比较用t检验。
2 结果
2.1 APS对3T3?L1前脂肪细胞增殖的影响 APS浓度从0.025到0.8 g/L，在24、48和72 h各时间段对前脂肪细胞的生长表现为增殖趋势，呈现一定的量效关系，其中浓度为0.2、0.4、0.8 g/L时在药物干预24、48、72 h时增加明显，与CON组相比，差异有统计学意义（P＜0.05, P＜0.01）。见表1。
表1 APS对3T3?L1前脂肪细胞增殖作用的量效关系（略）
Table 1 Dose?effects of APS on proliferation of 3T3?L1 preadipocytes
*P＜0.05, **P＜0.01, vs normal control group.
2.2 APS对3T3?L1脂肪细胞分化的影响 脂肪细胞油红O染色后进行OD值测定，APS组OD值明显高于CON组（P＜0.05），低于ROS组，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示APS能促进细胞内脂质积聚，促进细胞分化。见表2、图1。
2.3 APS对脂肪细胞PPARγ和C/EBPα mRNA表达的影响 APS组PPARγ mRNA表达量明显高于CON组，低于PPARγ激动剂ROS组（P＜0.05）；和CON组相比，APS和ROS均能增加C/EBPα mRNA的表达，但两者之间差异无统计学意义（P＞0.05)。见表3。
2.4 APS对脂肪细胞PPARγ和C/EBPα蛋白表达的影响 经内参β?actin校正后的结果表明，0.4 g/L的APS使PPARγ和C/EBPα蛋白的表达分别增加1.46和1.70倍，ROS则分别使其表达增加1.32和1.89倍，与CON组相比，差异有统计学意义（P＜0.05, P＜0.01），APS和ROS组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。
表2 APS对3T3?L1前脂肪细胞分化的影响（略）
Table 2 Effects of APS on differentiation of 3T3?L1 preadipocytes
*P＜0.05, **P＜0.01, vs normal control group
图1 APS对3T3?L1前脂肪细胞分化的影响（油红O染色，×200）（略）
Figure 1 Effects of APS on differentiation of 3T3?L1 preadipocytes (red O staining, ×200)
3T3?L1 preadipocytes were treated with APS (0.4 g/L) and ROS (10 μmol/L) respectively during cell differentiation. Pictures were taken at the 8th day. Vacuolus in the pictures represented lipid droplet and the degree of differentiation. UDP: undifferentiated preadipocytes; CON: normal control group; APS: Astragalus polysaccharides?treated group; ROS: rosiglitazone?treated group.
表3 APS对3T3?L1脂肪细胞PPARγ和C/EBPα mRNA 表达的影响（略）
Table 3 Effects of APS on PPARγ and C/EBPα mRNA expressions in 3T3?L1 adipocytes
*P＜0.05, **P＜0.01, vs normal control group; △P<0.05, vs ROS?treated group.
图2 APS对3T3?L1脂肪细胞PPARγ和C/EBPα蛋白表达的影响（略）
Figure 2 Effects of APS on expressions of PPARγ and C/EBPα proteins in 3T3?L1 adipocytes
3T3?L1 adipocytes were treated with APS (0.4 g/L) and ROS (10 μmol/L) respectively during cell differentiation. Cells were collected for immunoblotting at the 8th day. Each bar represents mean±standard error (SE) from three independent experiments. CON: normal control group; APS: Astragalus polysaccharides?treated group; ROS: rosiglitazone?treated group. *P＜0.05，**P＜0.01, vs normal control group.
3 讨论
脂肪组织不仅是机体被动的燃料贮存库和组织器官充填料，而且是一个巨大的内分泌系统，它分泌多种活性因子参与神经?内分泌?免疫的调节；脂肪细胞分化失常可引起脂肪的过多堆积，继而导致脂肪细胞内分泌功能失调而引起胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生［5, 6］。因此，近年来脂肪细胞分化的调控及其与肥胖、胰岛素抵抗发病机制的关系一直是国内外的研究热点。研究药物对脂肪细胞分化的影响，对于早期防治与肥胖和胰岛素抵抗密切相关的2型糖尿病、高血压、血脂紊乱和动脉粥样硬化等代谢相关性疾病及减轻其危害具有重要意义。PPAR属激素核受体超家族成员，由不同基因编码的3个亚型PPARα、PPARδ和PPARγ组成，其中PPARγ最具脂肪组织特异性，对脂肪细胞的分化起着重要作用。胰岛素增敏剂噻唑烷二酮（thiazolidinedione, TZD）和15?脱氧前列腺素J 2（15?dPJ 2）分别是PPARγ的合成配体和天然配体，与之结合可以促进脂肪细胞分化成熟。C/EBP家族有C/EBPα、β、γ等成员，其中C/EBPα在脂肪细胞分化中起着关键性作用，促进PPARγ的高表达，保持分化细胞的表型。TZD类药物ROS是目前胰岛素抵抗的代表药物，它能促进PPARγ表达增加和脂肪细胞的分化，促进葡萄糖转运，增加脂肪组织胰岛素敏感性。但ROS最终使脂肪积聚增多，引起体重增加，而肥胖与胰岛素抵抗具有高度相关性，造成了治疗上的矛盾。因此，寻求既能改善胰岛素抵抗又可不增加体脂和体重的药物对于代谢性疾病的防治极具意义。我们在临床观察到代谢综合征早期患者除超重、腹围增加外，多表现为体胖、气短、出汗多、乏力、腹胀满，舌苔多为薄苔，伴有血糖、血脂的异常。中医学认为这些改变属于气化功能障碍，其成因是在先天正气虚（脾、肺、肾三脏气虚）基础上，后天饮食恣意放纵，多食肥甘，嗜卧少动，使脾虚失运，肺虚失布，肝郁气滞，肾虚气化失职，体能消耗明显降低，营养过剩，机体不能很好利用和代谢这些营养物质，蓄积于体内，遂变为湿、痰、浊，久则郁热、湿滞、血瘀等相互集结，临床出现高血糖、高血脂等一系列糖脂代谢异常，进而成为心脑血管等疾病主要的危险因子。针对这种气虚为本、不运不化的病理状态，临床采取攻补兼施的治则，在健脾益气，协助恢复脾胃运化功能的基础上，采取或清郁热，或祛痰湿，或除瘀血等法治疗。中药黄芪味甘性微温，补益肺脾肾三脏之气，可以推动脾胃中焦枢机，助脾散精，使气血津液等精微物质得以正常布散运化，是治疗代谢综合征气虚的主药。近年来，许多临床和动物实验研究均表明，黄芪及其主要成分APS有改善胰岛素抵抗和调节糖脂代谢的作用，因此被广泛运用于2型糖尿病、高血压、代谢综合征等代谢相关性疾病的防治［1~4, 7］。在以往实验中，我们发现APS可增加脂肪细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进脂肪细胞的分化［3］，为了进一步探讨其影响脂肪细胞增殖和分化的机制，从影响脂肪细胞分化的两个关键转录因子方面做了深入的探讨。本实验结果表明APS在一定浓度范围内对脂肪细胞的生长表现为增殖趋势，且呈现一定的量效关系；APS能促进细胞内脂质的积聚，促进细胞分化；能够在mRNA及蛋白水平促进脂肪细胞分化关键因子PPARγ和C/EBPα mRNA的表达，表现出和TZD类药物ROS类似的效应，这可能是其改善胰岛素敏感性的机制之一。然而PPARγ激动剂ROS发挥作用是以对前脂肪细胞的募集、促分化及在细胞内积聚更多脂质为基础的，故其有负面影响，常常会引起体脂的聚积而造成体重增加等副作用［8, 9］，黄芪多糖是否有这方面的影响，如何进行防治等问题值得进一步深入研究。
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