氧化苦参碱在大鼠肾间质纤维化进程中的保护作用
作者：姚钢炼，宁宁，高登峰，桂保松
【关键词】 氧化苦参碱；纤维化；肾间质；转化生长因子
摘要：目的 探讨氧化苦参碱对大鼠肾间质纤维化进程的干预作用，并阐明其部分机制。方法 40只雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、苯那普利组、氧化苦参碱大剂量组和小剂量组。以单侧输尿管结扎术建立输尿管梗阻的动物模型。术后第14天取术侧肾组织行HE、Masson染色及转化生长因子β1(TGFβ1)、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和Ⅲ型胶原(ColⅢ)免疫组化检测，并运用图像分析系统做半定量分析。结果 经氧化苦参碱干预后，梗阻侧肾脏的αSMA 、TGFβ1和ColⅢ的表达均显著低于模型组(P<0.01)；大剂量氧化苦参碱组均低于苯那普利组(P<0.05)；氧化苦参碱大剂量组和小剂量组之间无显著性差异(P>0.05)。结论 氧化苦参碱可能是通过降低TGFβ1等细胞因子的表达而减少细胞外基质(ECM)产生细胞的活化，从而减少ECM的沉积，达到抗肾间质纤维化的作用。
关键词：氧化苦参碱；纤维化；肾间质；转化生长因子β；肌成纤维细胞
The protective function of oxymatrine on renal interstitial fibrosis in rats
ABSTRACT: Objective To investigate the protective function of oxymatrine on the renal intestitial fibrosis in rats. Methods Forty male Sprague Dawley rats were randomly divided into 5 groups: sham group, model group, Lotensin group, largedose oxymatrine group, and smalldose oxymatrine group. The models were established by unilateral ureteral obstruction(UUO) of the left side. On the 14th day after operation, the obstructed kidney was taken out. Then, HE, Massion, and immunohistochemistry staining of transforming growth factorβ1(TGFβ1), αsmooth muscle acting (αSMA) and collagen Ⅲ were conducted. After that, semiquantitative analysis was performed. Results After oxymatrine, treatment, the expressions of αSMA, TGFβ1 and ColⅢ of the obstructed kidney in the treatment group were significantly lower than those in the model group (P<0.01); the expressions in the largedose oxymatrine group were lower than those in the lotensin group; while there were no significant difference between the largedose and smalldose oxymatrine groups (P>0.05). Conclusion Oxymatrine may reduce the expression of cytokines such as TGFβ1, then the activation of cell producing ECM and then the sendimentation of ECM, thus preventing renal interstitial fibrosis.
KEY WORDS: oxymatrine; fibrosis; renal interstitium; transforming growth factorβ; myofibroblast
肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病的最终结果，是导致慢性肾衰竭的主要原因之一[1]。肾小管间质细胞表型转化、致纤维化细胞因子过度表达、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成降解失衡及大量积聚等因素在肾间质纤维化的发生、发展过程中起着重要作用。因此,寻找针对肾间质纤维化发生机制的药物,将是防治肾间质纤维化、延缓尿毒症发生的有效措施。氧化苦参碱是苦参型生物碱的主要活性成分，具有多方面的药理作用和功效。已有研究发现，氧化苦参碱对肝脏、皮肤及心肌纤维化具有防治作用[2]，但其对肾间质纤维化的作用还未见报道。本实验运用大鼠单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruction, UUO)建立肾间质纤维化动物模型,给予大鼠氧化苦参碱灌胃,通过观察肾间质病理变化，测定转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)、α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin, αSMA)以及Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ, ColⅢ)的合成表达情况，探讨氧化苦参碱对大鼠肾间质纤维化的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 雄性 SD大鼠40只，清洁级，体重180-200g，由西安大学动物实验中心提供。随机分为5组，每组8只，分别为：假手术组(A组)：蒸馏水 10mL/(kg・d)；模型组(B组)：蒸馏水10mL/(kg・d)；苯那普利组(C组)：苯那普利10mg/(kg・d)，北京诺华制药有限公司；氧化苦参碱大剂量组(D组)：氧化苦参碱100mg/(kg・d)，西安鸿生生物技术有限公司；氧化苦参碱小剂量组(E组)：氧化苦参碱50mg/(kg・d)。各组于术前1d开始灌胃给药。
1.2 造模方法 UUO致肾小管间质纤维化模型参照[3]。A组打开腹腔后分离左侧输尿管，并不结扎即关闭腹腔。术后第14天处死各组大鼠，取梗阻侧肾脏，用10%(体积分数)中性甲醛固定。
1.3 免疫组织化学染色 采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶法(SP法)。2μm厚的石蜡切片常规脱蜡水化，用含3%(体积分数)H2O2的甲醇封闭内源性过氧化物酶(抗原修复采用煮沸法)。正常山羊血清封闭液室温封闭20min后，分别加小鼠抗人αSMA单克隆抗体(1∶50，北京中山公司，适用于人、大鼠、兔)，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体(1∶50，Santa Cruz，美国)，小鼠抗人ColⅢ单克隆抗体(1∶50，北京中山公司，适用于人、大鼠、兔)，4℃冰箱过夜。再加生物素标记的山羊抗兔Ⅱ抗(TGFβ1)或山羊抗小鼠Ⅱ抗(αSMA，ColⅢ)(北京中山公司)，37℃孵育30min，链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶37℃ 30min，DAB显色3min，蒸馏水冲洗终止显色。苏木素复染核2min，自来水冲洗，常规脱水、透明、封片。同时用正常血清作阴性对照。
1.4 肾小管间质病理评分 Masson染色后，在低倍镜下(×100)依序单盲(观察者不知标本来源的差异性)观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾间质视野，分别肾脏组织间质损伤指数、纤维化指数、细胞浸润程度评分[4]，然后分别计算各个评分的均值。
1.5 图像分析 采用Qwin550CW型图像信号采集与分析系统(Leica，德国)，分别对各组免疫组化染色的肾脏标本切片进行灰度值测量。每组测量来自不同个体的8张组织切片，高倍镜下(×400)每张切片分别取2个视野，每个视野面积约为0.1mm2。测量时每个视野随机测量4个随机面积内阳性显色的平均灰度值，每组共测量64(8×2×4)个数据。灰度值越高表明相应蛋白表达越低，反之则表明相应蛋白表达越高。
1.6 统计学处理 数据均采用(±s)表示，用SPSS12.0统计软件进行统计分析。组间差异比较用单因素方差分析，两两比较用SNKq检验，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 肾组织病理改变 肾组织HE及Masson染色显示，B组间质大量炎性细胞浸润和纤维组织增生，部分肾小管萎缩、管腔闭塞或扩张、坏死，小管间质区面积扩大，小管基底膜不同程度断裂增厚；C、D、E组间质可见少量的炎性细胞浸润，少量纤维组织增生，肾小管轻度扩张。
2.2 肾间质病理评分 C、D、E组肾间质损伤指数、间质纤维化指数、间质炎性细胞浸润程度均显著低于B组(P<0.05)，而C、D、E组间无显著性差异(表1)。
表1 各组肾脏组织的间质损伤指数、纤维化指数及细胞浸润程度比较（略）
Table 1 Renal interstitial damage index, fibrosis index,and cellular infiltration level of each group
*P<0.01 vs. sham, △P<0.01 vs. model
2.3 肾组织内αSMA表达 镜下可见，A组αSMA只在正常肾组织血管壁上表达，小球和小管中无阳性染色；B、C、D、E组除血管壁上有表达外,可见大量的阳性细胞出现在肾间质中，同时部分小管上皮细胞胞浆内也出现阳性棕黄色染色颗粒，其中以B组更为明显。各组大鼠肾小球内均无明显αSMA阳性染色。免疫组化半定量结果统计分析示，B、C、D、E组肾脏αSMA蛋白表达显著高于A组(P<0.01)，C、D、E组显著低于B组(P<0.01)，D、E组又低于C组(P<0.05，表2，图1)。
2.4 肾组织内TGFβ1表达 镜下可见，A组肾小管上皮细胞胞浆内出现少量TGFβ1棕黄色颗粒状阳性染色；TGFβ1在B、C、D、E组肾小管上皮细胞胞浆中表达增多，其中以B组更为明显。免疫组化半定量结果统计分析示，B、C、D、E组肾脏TGFβ1蛋白表达显著高于A组(P<0.01)，C、D、E组显著低于B组(P<0.01)，D组又低于C组(P<0.05)，D、E组之间无显著性差异(表2，图2)。
2.5 肾组织内ColⅢ表达 镜下可见，A组肾脏ColⅢ表达极少，在肾间质基质中呈散在黄色细线样分布；B、C、D、E组表达增多，呈局部或弥漫棕黄色条索状分布，其中以B组更为明显。免疫组化半定量结果统计分析示，B、C、D、E组肾脏ColⅢ表达显著高于A组(P<0.01)，C、D、E组显著低于B组(P<0.01)，D组又低于C组(P<0.01)，D、E组之间无显著性差异(表2，图3)。
表2 各组肾脏组织αSMA 、TGFβ1、ColⅢ免疫组化阳性显色平均灰度值比较（略）
Table 2 Gray scale of αSMA ，TGFβ1，ColⅢ in renal by immunohistochemistry
*P<0.01 vs. sham ,△P<0.01 vs. model, ▲P<0.05 vs. Benazepril
图1 大鼠肾脏组织αSMA免疫组化染色（略）
Fig.1 Expression of αSMA in renal tissue of rat(SP ×400)
a: model group; b: oxymatrine in large dose group
图2 大鼠肾脏组织TGFβ1免疫组化染色（略）
Fig.2 Expression of TGFβ1 in renal tissue of rat(SP ×400)
a: model group; b: oxymatrine in large dose group
图3 大鼠肾脏组织ColⅢ免疫组化染色（略）
Fig.3 Expression of ColⅢ in renal tissue of rat (SP ×400)
a: model group; b: oxymatrine in large dose group
3 讨论
苦参系药用豆科槐属植物苦参的干燥根,性寒味苦,始载于我国最早的药学《神农本草经》。随着分离提取技术的进步,发现在苦参、苦豆子、广豆根中存在同一类以氧化苦参碱为代表的生物碱。氧化苦参碱是苦参型生物碱的主要活性成分,具有多方面的药理作用和功效,如抗菌、抗炎、抗纤维化、抗风湿、抗肿瘤、抗心律失常、消肿利尿、免疫及生物反应调节作用等[2]，有广阔的临床应用前景，特别是在抗组织纤维化方面的作用，受到极大的关注[5]。
正常时ECM产生的细胞处于静息状态，其代谢和功能不活跃，但在病理情况下，ECM产生的细胞不仅形态发生改变，而且表现出明显的增殖、分泌细胞因子、合成大量ECM和产生蛋白降解酶等功能变化。这一系列变化被称为活化[6]。肌成纤维细胞是一组平滑肌细胞样的细胞，胞浆内出现αSMA是其活跃的标志性抗原[7]。早期研究认为肌成纤维细胞是由成纤维细胞分化而来，但后来的研究证明，肌成纤维细胞也可由其他ECM产生的细胞转化而来。在肾间质，成纤维细胞是肌成纤维细胞的主要来源，在一定条件下肾小管上皮细胞可转化为肾间质肌成纤维细胞[8]。目前，αSMA被公认是较好的反应肾间质纤维化程度的形态测量学指标，αSMA表达的多少与肾间质纤维化的程度以及肾脏疾病的进展呈正相关[9]。本实验结果表明，经氧化苦参碱干预后，UUO大鼠梗阻侧肾组织内αSMA阳性表达程度较模型组明显减少，提示氧化苦参碱可以抑制细胞的转分化作用。在氧化苦参碱预防半乳糖胺诱导的大鼠肝纤维化的实验研究中，杨文卓等[5]结果显示，氧化苦参碱预防组中αSMA的表达较模型组明显减少，提示氧化苦参碱对胶原合成的抑制作用可能与其抑制ECM产生细胞的活化有关。结合本实验结果，我们推测氧化苦参碱亦可能通过抑制ECM产生细胞的活化来减少肾间质纤维化的发生。
目前普遍认为，在肾间质纤维化的早期阶段, TGFβ1是较好的治疗靶点[10]。Miyajima等[11]在UUO后1d开始用 TGFβ单克隆抗体干预，13d后处死大鼠，发现梗阻侧肾脏组织TGFβ表达较模型组显著降低，并且间质容积、胶原蛋白mRNA、肾小管上皮细胞凋亡、增殖以及小管萎缩程度均相应的显著降低，近期文献也有类似报道[1213]。大量研究表明氧化苦参碱能抑制肝脏内、皮肤瘢痕组织内TGFβ1蛋白表达水平，从而达到抑制组织纤维化的作用[14]。张宏文等[15]在苦参碱对大鼠肾小球硬化早期防护作用的实验研究中发现，苦参碱可以通过直接抑制TGFβ1的表达，从而抑制肾小球固有细胞的活化、增殖及细胞外基质的分泌,起到抗肾小球硬化的作用。本研究结果显示，经氧化苦参碱治疗后，肾小管上皮细胞内TGFβ1蛋白表达明显降低，表明氧化苦参碱可能在一定程度上抑制了TGFβ1蛋白的表达。
本实验结果发现，经大剂量氧化苦参碱干预后，TGFβ1、αSMA蛋白的表达均低于苯那普利组，但肾间质损伤指数、纤维化指数和细胞浸润程度评分两组无显著性差异。因此并不能说明氧化苦参碱抗肾间质纤维化作用优于苯那普利，两种药物对于肾间质纤维化的作用比较还需要进行更系统的实验来研究。此外，本实验分别采用大、小剂量氧化苦参碱来观察其干预大鼠肾间质纤维化的效果，在肾间质病理评分以及某些免疫组化指标中并未发现其作用效果的差异性，其可能与干预的时间以及剂量的选取区间有关。关于氧化苦参碱对于大鼠肾间质纤维化干预作用的剂量依赖效应如何，还需进一步实验来观察。
综上所述，氧化苦参碱可能通过降低TGFβ1等细胞因子的表达，减少ECM产生细胞的活化，从而减少ECM的沉积，达到抗肾间质纤维化的作用。
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