脐血胰岛素样生长因子?2和印记基因H19与胎儿生长受限的关系

                       作者：杨新园，苟文丽，王海燕  

【摘要】  目的 探讨脐血胰岛素样生长因子?2(IGF?2)和H19印记状态与胎儿生长受限(FGR)的关系。方法 采用放射免疫法测定42例FGR孕妇(研究组)和晚期正常妊娠妇女30例(对照组)脐血中IGF?2水平，同时采用逆转录多聚酶链反应(RT?PCR)技术，检测胎盘组织中H19基因印记状态。结果 ①研究组脐血IGF?2水平为(1.52±0.20)μg/L，明显低于对照组的(1.97±0.21)μg/L(P<0.05)。②研究组中杂合子20例，其中9例双等位基因表达；对照组中杂合子14例，均为单等位基因表达；研究组H19基因印记丢失明显高于对照组(P<0.05)。③研究组H19双等位基因表达的病例脐血IGF?2水平均明显低于H19杂合性丢失和H19单等位基因表达病例(P<0.05)；H19杂合性丢失和H19单等位基因表达病例脐血IGF?2水平无显著性差异。结论 妊娠晚期IGF?2减低是导致FGR发生的原因之一；H19基因印记丢失下调IGF?2基因间接影响胎儿生长发育。

【关键词】  胰岛素样生长因子?2；印记基因H19；胎儿生长受限

　　Study on relationship between fetal growth retardation and expression　of insulin?like growth factor?2 and H19 imprinted genes

　　ABSTRACT: Objective  To study the relationship between fetal growth retardation (FGR) and expression of insulin?like growth factor?2 and H19 imprinted genes. Methods  Immunoradioassay was used to detect the insulin?like growth factor?2(IGF2)level in cord blood from 42 pregnant women with FGR (FGR group) and 30 normal pregnant women (normal group). Reverse transcription?polymerase chain reaction method (RT?PCR) was used to detect H19 imprinted genes allele?specific expression level in placenta. Results  The level of IGF2 in cord blood from FGR group was (1.52±0.20)μg/L. It was significantly decreased as compared with that from the normal group (1.97±0.21)μg/L (P<0.05). Among the 42 cases of FGR tissue samples, we observed 20 heterozygous cases. In normal tissues there were 14 heterozygous cases. Nine cases of 20 in the FGR group showed biallelic expression of H19, whereas no biallelic expression was demonstrated in the normal group (P<0.05). The level of  IGF2 from biallelic expression of H19 in FGR group was low as compared with that from samples of loss of heterozygosity and loss of biallelic expression cases. Conclusion  The decrease of fetal serum concentration of IGF2 is one of the direct factors contributing to FGR. And loss of imprinting of H19 gene may be one of the indirect factors contributing to FGR by down?regulation of IGF?2.

　　KEY WORDS: insulin?like growth factor?2; H19 genomic imprinting; fetal growth retardation

　　胎儿生长受限(fetal growth retardation, FGR)是产科严重的并发症之一，其围产儿死亡占全部围产儿死亡的42.3%。FGR不仅胎儿期生长发育受限，而且影响体能与智力远期发育。近年来有学者提出，胰岛素样生长因子?2(insulin?like growth factor?2, IGF?2)及其交互印记基因H19在胎儿生长发育的全过程中均起着关键作用[1]，二者对早期蜕膜和绒毛滋养层发育分化、胎盘形成及功能和胚胎生长发育发挥重要的调节作用。本研究旨在探讨IGF?2及H19基因与FGR的关系，为FGR病因学研究提供依据。

　　1  资料与方法

　　1.1  临床资料  选择2003年1月至2005年1月在我院产科住院分娩的FGR孕妇42例作为研究组，FGR诊断标准参照《妇产》第六版(人民卫生出版社)。诊断标准：孕周无误，连续两次以上产前检查测量孕妇子宫高度低于孕期正常宫底高度第10个百分位数以下，B超检查胎头双顶径增长速度3周<4mm。选择同期正常健康孕妇30例为对照组，新生儿体重>2500g，<4000g。孕妇年龄分别为(25.78±2.63)岁和(25.88±2.83)岁，平均孕期(259.69±9.71)d和(270.69±7.92)d。两组孕妇均无吸烟、无其他妊娠合并症及并发症，均为初产、单胎。分娩方式：研究组阴道分娩38例，剖宫产4例；对照组阴道分娩22例，剖宫产8例。

　　1.2  研究方法

　　1.2.1  标本采集  所有研究对象于胎儿娩出后抽取脐静脉血5mL于室温下静置1h后离心，取血清置-80℃保存待测。胎盘娩出后行无菌操作立即于胎盘中央部位近母面取组织块约1cm×1cm×1cm，放置于液氮中保存待测。胎儿及胎盘娩出后即分别精确称重。

　　1.2.2  测定方法  ①采用放射免疫法(IRMA)测定脐血IGF?2水平，药盒由北京东亚免疫技术研究所提供，批内变异系数<5%，批间变异系数<10%。②按常规方法提取、纯化H19DNA。H19基因的DNA多态性区域用引物H1(sense)5′?TACAACCACCTGCACTACCTG?3′和H3(antisense)5′?TGGAATGCT TAGAGGCTGCT?3′，进行PCR扩增。扩增反应按以下程序进行：94℃ 4min，然后94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，循环35次，最后72℃延伸8min。PCR产物回收纯化后经限制性内切酶RsaⅠ酶切过夜，酶切产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳，筛选出杂合子。③采用RT?PCR技术检测H19印记状态。胎盘组织匀浆后，Trizol试剂提取总RNA，反转录为cDNA。H19基因RT?PCR反应体系引物为H1和H3，扩增反应同基因组DNA。扩增产物分别用RsaⅠ内切酶进行酶切过夜，然后进行15g/L琼脂糖电泳检测，用电泳凝胶成像系统摄像。实验均设阴性对照。所用引物、试剂均购自大连宝生生物公司。

　　1.3  统计学处理  应用SPSS11.0软件进行数据处理，统计学分析方法采用精确概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  两组孕妇脐血IGF?2水平的比较  放射免疫法检测结果显示，研究组脐血IGF?2水平为(1.52±0.20)μg/L，对照组为(1.97±0.21)μg/L，研究组脐血IGF?2水平明显低于对照组(P<0.05)。

　　2.2  胎盘组织杂合子病例检测  PCR法检测胎盘组织，从研究组和对照组中分别提取gDNA，PCR扩增后RsaⅠ酶切，见两条片段655bp(a)和485bp(b)，表明为杂合子，仅一个片段655bp(a)或485bp(b)表明丢失杂合性(a：未被RsaⅠ酶消化的片段；b：被RsaⅠ酶消化的片段) 。研究组中20例为杂合子病例，对照组中14例为杂合子，组间比较无统计学意义(P>0.05，图1)。

　　图1  筛选H19杂合子（略）

　　Fig.1 Analysis of H19 heterozygosity

　　1: 100bp marker; 2,4,5: RsaⅠ?digested PCR products of H19 yielded two bands of 655 and 485bp, indicating heterozygosity of H19; 3,6: a single band of a 655 or 485bp band in tissues indicated a loss of heterozygosity; 7: mock controls , which lacked reverse transcriptase

　　2.3  H19等位基因表达分析  PCR扩增产物为575bp，而gDNA扩增为655bp片段，用RsaⅠ酶切未消化的为a片段(655bp或575bp)，消化的是b片段(gDNA：485bp和170bp；cDNA：405bp和170bp)。含有a和b片段为双等位基因表达，仅含a或b片段为单等位基因表达。研究组20例杂合子病例中9例H19双等位基因表达，对照组14例杂合子均为单等位基因表达，两组比较有统计学意义(P<0.05，图2)。

　　2.4  IGF?2与H19基因间的关系  研究组组内比较， H19双等位基因表达的病例脐血IGF?2水平为(1.38±0.23)μg/L，与H19单等位基因杂合子的(1.56±0.15)μg/L和H19杂合性丢失病例的(1.58±0.18)μg/L比较均有显著性差异(P<0.05)；而H19单等位基因杂合子和H19杂合性丢失病例脐血IGF?2水平比较，无显著性差异。

　　图2  H19印记状态检测（略）

　　Fig.2 Imprinting results of H19 genes

　　1: 100bp marker; 2,4: PCR products of H19 gDNA were digested with RsaⅠ; 3, 5: PCR products of H19 cDNA were digested with RsaⅠ. RsaⅠ?digested PCR products of H19 yielded two bands of 575 and 405bp, indicating biallelic expression of H19; 6: mock controls, which lacked reverse transcriptase

　　3  讨论

　　IGF?2的主要作用是促进细胞的增殖、分化、合成和代谢，与着床前胚胎的发育、滋养细胞侵入蜕膜、胎盘和胚胎的生长发育等过程有关[1?2]。许多动物和人类的实验均证实，IGF?2 mRNA在早孕期滋养细胞中高度表达，并且呈浓度梯度变化，在侵入母体蜕膜前端的细胞滋养细胞中最为丰富，提示IGF?2与调节滋养细胞侵入母体蜕膜的过程有关。Sibley等破坏小鼠的IGF?2基因，结果小鼠显示出生长受限，而且其胎盘重量减轻。Lopez进一步研究发现，小鼠缺乏IGF?2基因导致FGR，其机制主要是IGF?2基因表达减低、翻译IGF?2因子减少，使胎盘转运葡萄糖减少，并影响糖原的代谢，在妊娠中晚期导致胎儿与胎盘生长受限。本研究结果显示，脐血中IGF?2水平与FGR的发生有显著的相关性，进一步证明了IGF?2是胎儿发育所必需的生长因子，在胎盘形成和胚胎生长发育过程发挥重要的调节作用。IGF?2基因表达减低致使IGF?2因子减少，无法满足细胞的正常生理需要，将直接影响胎儿的生长发育。H19基因位于染色体11p15.5位点，IGF?2基因紧密连锁，与表达调控相关，仅有mRNA表达。H19基因是一种生长调节基因，在胚胎和胎盘组织中高度表达[3]。Angiolini等[4?5]发现H19mRNA能使许多基因上调，而这些基因又与细胞迁移、血管形成和胎盘血流有关，认为H19在改变胎盘功能和胚胎生长﹑发育及个体行为方面起重要作用。H19和IGF?2基因交互印记，正常情况下均单等位基因表达。IGF?2基因由父系等位基因表达，母系印记；相反，H19基因母系表达，父系印记。其基因表达模型为：对于母系等位基因，印记调控区—差异性甲基化区(DMR)的去甲基化状态使其能与增强子阻遏蛋白(CTCF)结合，CTCF阻断增强子对IGF?2基因启动子的作用，使IGF?2不能有效地转录，而只能促成H19基因的表达，IGF?2基因沉默；对父系等位基因而言，DMR发生甲基化，不能与CTCF结合，因而CTCF不能阻断增强子对IGF?2启动子的作用，使得 IGF?2能有效地表达，而H19转录受到了抑制。因此在母源染色体上IGF?2表达减少但H19激活；而在父源染色体上IGF?2表达激活而H19表达减少。因此，H19基因可通过印记调控区对IGF?2基因的表达进行调控。本研究结果显示，在研究组中H19基因呈双等位基因表达，印记丢失明显高于对照组，有显著性差异，说明H19基因与FGR的发生有关。此外，H19双等位基因表达可使脐血IGF?2水平显著下降。我们认为H19和IGF?2这两个基因在促进胚胎发育作用上是相互关联的，当H19基因发生印记丢失，呈双等位基因表达，对于父系等位基因而言，原本沉默的H19基因表达异常，使DMR呈去甲基化状态与增强子阻遏蛋白CTCF结合，CTCF阻断增强子对IGF?2基因启动子的作用，IGF?2基因不能有效地转录，表达IGF?2因子减少。因此，H19基因在印记丢失情况下可能通过差异性甲基化区等复杂机制下调IGF?2基因，使其不能有效地表达IGF?2[6] ，从而间接影响胎盘功能，抑制胎儿发育，导致FGR的发生。研究组比较，H19双等位基因表达的病例脐血IGF?2水平均明显低于H19杂合性丢失或H19单等位基因表达病例；而H19杂合性丢失和H19单等位基因表达病例脐血IGF?2水平并无显著性差异。因此，对于脐血IGF?2水平下降而H19呈单等位基因表达的FGR病例，可能是由于环境等非遗传因素引起FGR的发生。提示H19基因印记丢失是FGR发生的原因之一，并在胎儿生长发育全过程中可能起了较IGF?2更为关键的作用。

【】
  　　[1]Constancia M, Hemberger M, Hughes J, et al. Placental?specific IGF?Ⅱ is a major modulator of placental and fetal growth [J]. Nature, 2002, 417(6892):945?948.

　　[2]张春莲，颜建华，孙永玉. 印迹基因H19和IGF2的遗传学特征与生物学意义 [J]. 中华医学遗传学杂志, 1998, 3(15):173?174.

　　[3]Charalambous M, Menheniott TR, Bennett WR, et al. An enhancer element at the Igf2/H19 locus drives gene expression in both imprinted and non?imprinted tissues [J]. Dev Biol, 2004, 271:488?497.

　　[4]Angiolini E, Fowden A, Coan P, et al. Regulation of placental efficiency for nutrient transport by imprinted genes [J]. Placenta, 2006, 24:612?615.

　　[5]Reik W, Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome [J]. Nat Rev Genet, 2001, 2(1):21?32.

　　[6]丁健华,蔡刚. H19/IGF2基因印记调控机制研究进展 [J]. 国外医学分子生物学分册, 2003, 4(25):241?246.