结缔组织生长因子对视网膜色素上皮细胞增生和黏附的调节作用
作者：郭长梅，惠延年，王雨生，田艳明，王静波，马吉献
【摘要】 目的 观察重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)对视网膜色素上皮(RPE)细胞增生和黏附的影响。方法 用CTGF蛋白、多聚赖氨酸(PLL)和胶原分别包被培养板，观察CTGF促进RPE细胞黏附的作用；用四唑盐(MTT)比色试验和流式细胞仪(FCM)测定RPE细胞增生反应。结果 10-30mg/L的CTGF蛋白提高RPE细胞的贴壁黏附能力，与未包被的对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；30mg/L CTGF促进RPE细胞黏附的能力与0.1g/L胶原的作用一致，但略低于0.1g/L PLL的作用。MTT实验显示CTGF刺激RPE细胞生长，CTGF作用24h刺激RPE细胞增生的能力最强。FCM测定细胞周期结果显示S期百分比随着CTGF浓度增加而逐渐增加，无血清培养的对照组S期百分比为(7.5±0.4)%，60μg/LCTGF刺激24h后，S期百分比上升至(16.1±2.0)%。结论 CTGF可以促进RPE细胞的黏附和增生，在增生性玻璃体视网膜病变等眼内增生性疾病中可能有重要意义。
【关键词】 结缔组织生长因子；视网膜色素上皮细胞；细胞黏附；细胞增生
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是孔源性视网膜脱离及其视网膜复位手术后的严重并发症，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞是其主要的增生细胞[1]。RPE细胞在炎性因子等刺激下游离移行，离开原位后附着在玻璃体纤维、视网膜表面和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)上，才能获得异常增生分化的能力。RPE细胞的黏附和异常增生，是PVR病理过程的重要环节,也是目前研究的一个热点。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是近几年发现的一个新的分泌型生长因子，分子质量为38ku、富含半胱氨酸的分泌蛋白，属于近年发现的一个新的即刻早期基因家族——CCN 家族的成员，具有多种生物学功能，包括参与调节多种细胞的生长及ECM的产生，在细胞分化和组织创伤愈合等生物学过程有重要意义[2?3]。在本研究中，我们的目的是观察重组人CTGF(rhCTGF)对RPE细胞增生和黏附功能的影响，为防治PVR提供一个新思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
rhCTGF(32mg/L)由医学院医学生物学研究所病毒免疫室李琦涵教授惠赠；多聚赖氨酸(poly?L?lysine, PLL)、胶原、小牛血清白蛋白(BSA)、四唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；DNA?Prep Reagent System 试剂盒购自美国Coulter公司。
1.2 人RPE细胞培养与鉴定
从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球，于死亡后24h内分离培养RPE细胞，具体方法王雨生等报道的方法[4]。传代细胞用含10%(体积分数)小牛血清的Dulbecco改良Eagle 培养基和Ham?s F12(DMEM/F12)的混合完全培养基(青霉素100u/mL，链霉素100u/mL)，置于37℃、5%(体积分数)CO2孵箱中培养；用抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。取第4-7代细胞用于实验。
1.3 RPE细胞黏附试验
1.3.1 包被培养板
将纯化的rhCTGF用0.01mol/L PBS配成 5、10、20、30mg/L 4种不同质量浓度。将4种不同质量浓度rhCTGF、PLL(0.1g/L)、胶原(0.1g/L)分别加入96孔板中，每孔50μL，4℃下孵育16h；10g/L BSA 室温下孵育1h，封闭未饱和的蛋白结合位点，无菌PBS冲洗每孔2遍，在超净台中吹干。未包被的培养板作为对照。
1.3.2 黏附试验
消化收集近铺满期的RPE细胞，用无血清培养液洗涤细胞2次(1000r/min，离心5min)，以2.5×105/mL细胞密度重悬于含10g/L BSA的无血清DMEM/F12培养基中，每孔50μL细胞悬液接种于包被好的96孔板中，置于37℃培养箱中让细胞贴壁。60min后将培养板取出，无菌PBS洗涤每孔2遍以洗去未贴壁细胞。每孔加入含MTT溶液(5g/L，20μL)的新鲜培养液150μL。继续培养4h，弃培养液，每孔加入150μL DMSO，充分振荡10min，在酶联免疫检测仪上在490nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A值)。每个浓度设8个重复孔，试验重复3次。
1.4 CTGF对RPE细胞促增生作用
1.4.1 实验分组
①无血清对照组；② 无血清培养液+rhCTGF组：设4种质量浓度，分别为5、15、30和60μg/L。
1.4.2 MTT比色试验
2.5g/L胰蛋白酶消化单层培养的RPE细胞，用含10%(体积分数)血清的DMEM/F12培养液制成单个细胞悬液，调整RPE细胞密度为1×104/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL。置于37℃ CO2孵箱中培养24h，换用无血清的DMEM/F12培养液使细胞静止24h。按实验分组，再分别加入含不同浓度rhCTGF的新鲜无血清培养液。继续培养12、24、36和48h。在不同培养时间点，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，37℃继续孵育4h，中止培养，弃孔内上清液。每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上在490nm波长测定各孔A值，细胞生长促进率。设不接种细胞的空白调零孔。每组实验设8个重复孔，实验重复3次。生长促进率＝[(实验组A值-对照组A值)÷对照组A值]×100%
1.5 流式细胞术(FCM)测定细胞增生周期
近铺满期RPE细胞消化后，以1×104/mL的细胞密度等量接种于5个25cm2的细胞培养瓶中，置于37℃ CO2孵箱中培养24h，换用无血清的DMEM/F12培养液使细胞静止24h。按实验分组，再分别加入含不同质量浓度rhCTGF的新鲜无血清培养液，继续培养24h，2.5g/L胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，加入1mL PBS将细胞混匀，再加入2mL无水乙醇立即振荡混匀，用封口膜封口，置于4℃冰箱固定24h后送检。检测前用PBS洗涤细胞2次，调整细胞密度为1×106/mL，取100μL样品，加入DNA?Prep stain染料500μL在室温中避光染色15min，上机检测。FCM检测时所用激光波长为488nm，发射波长为525nm，激光功率为260mW。每份样本均检测5500个细胞，用DNA MultiCycle 软件进行统计拟合分析。实验重复3次。
1.6 统计学处理
试验数据均用±s表示，采用SPSS 10.0 统计软件行t检验分析两组间差异，显著性水准设为0.05。
2 结 果
2.1 人RPE细胞培养与鉴定
第3代人RPE细胞经免疫细胞化学法行抗人细胞角蛋白(CK)染色，可见细胞浆呈棕黄色着色，表现为CK免疫反应阳性，阳性率为100%。
2.2 CTGF对RPE细胞黏附的影响
为了排除其他血清蛋白以及细胞增生对试验结果的影响，我们采用含10g/L BSA的无血清培养液，RPE细胞在无血清培养液中的贴壁能力较弱。10-30mg/L的CTGF蛋白和PLL(0.1g/L)、胶原(0.1g/L)包被培养板，均可以提高RPE细胞的贴壁黏附能力，与未包被的对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。并且CTGF介导RPE细胞黏附呈剂量依赖性。30mg/L CTGF促进RPE细胞黏附的能力与0.1g/L胶原的作用一致，但略低于0.1g/L 的PLL(图1)。
2.3 CTGF对RPE细胞增生的影响
2.3.1 MTT比色实验
无血清DMEM/F12静止的RPE细胞，加入不同浓度rhCTGF作用12、24、36和48h后，MTT法测定反映细胞数的A值，结果见表1。15-60μg/L CTGF均可以刺激RPE细胞生长,呈剂量依赖性，与对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05)。5μg/L CTGF在24h的A值与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)，其余各时间点的差异无统计学意义。从图2可见，CTGF作用24h刺激RPE细胞增生的能力最强。表1 MTT法检测rhCTGF对RPE细胞增生的影响（略）
2.3.2 FCM测定细胞周期
rhCTGF处理无血清培养的RPE细胞24h后，FCM检测细胞周期各期的数值见表2，DNA波形图见图3。经统计学检验，RPE细胞的S期百分比随着CTGF浓度增加而逐渐增加，15-60μg/L CTGF组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。表2 rhCTGF处理RPE细胞后细胞周期的变化（略）
3 讨 论
CTGF对多种细胞的生长具有调节作用，在体外能诱导多种细胞增生，如CTGF可刺激正常大鼠肾成纤维细胞 (NRK)增生，刺激DNA合成[5]。Shimo 等[6]研究发现用CTGF反义寡核苷酸或反义RNA阻断内源性CTGF的表达，也可以抑制血管内皮细胞的增生。CTGF通过调控周期蛋白依赖性激酶p27Kipl引起pRb超磷酸化，释放E2F，调控cyclin A基因的转录，升高cyclin A水平，使细胞从G1晚期进入S期，从而调节TGFβ的促有丝分裂活性；在成纤维细胞中还可持续活化p42/p44 MAPKs，促进细胞增殖[5]。CTGF具有ECM相关的信号蛋白属性，既是肝素结合型ECM相关蛋白，又与Von Willegrand因子、血小板反应蛋白等其他ECM相关信号蛋白有类似序列，可以和细胞膜上的超家族受体整合素结合[2,7]。整合素在正常情况下是无活性的，一旦在激素、细胞因子、ECM或其他细胞的刺激下，其构型和亲和力发生改变，可以与局部黏附的激酶结合产生作用，激活MAPK p42/44 和Rac，引起细胞内一系列生化改变。CTGF即通过此信号传导机制来调节细胞的生物学功能，如Fisp12(鼠源性CTGF)通过αvβ3整合素依赖途径促进血管内皮细胞的黏附、存活[8]。近来还发现CTGF经整合素α6β1和细胞表面乙酰肝素硫酸酯蛋白聚糖(HSPGs)介导与成纤维细胞的黏附[9]。CTGF在较高质量浓度(mg/L)时同样促进上皮细胞的黏附[10]，与我们的实验结果一致。孔源性视网膜脱离发生时，刺激RPE细胞重新进入细胞周期和活力增加的原因目前尚不清楚，但似乎与RPE细胞间的接触丧失以及对某些生长因子的敏感性增强有关[11]。RPE细胞开始移行、黏附、异常增生并分泌胶原等ECM，以此来修复缺损区。Hinton等[11]用免疫组化方法证实PVR增生膜的实质细胞和细胞外基质中存在CTGF高表达。Meyer等[12]从基因水平证实增生性视网膜疾病的纤维血管膜中转化的RPE细胞和成纤维细胞样细胞表达CTGFmRNA，并且与Ⅰ型胶原和细胞黏合素的表达有一致性。我们以前的研究也显示PVR增生膜上高表达CTGFmRNA[13]。本实验采用MTT法和FCM发现CTGF可以剂量依赖性地刺激无血清培养的RPE细胞增生；10-30mg/L的CTGF蛋白可以提高RPE细胞的贴壁能力，介导RPE细胞黏附呈剂量依赖性，30mg/L CTGF促进RPE细胞黏附的能力与0.1g/L胶原的作用一致，但略低于0.1g/L PLL的作用。以上研究结果提示CTGF可以促进RPE细胞的黏附和增生，在PVR等眼内增生性疾病中可能有重要意义。致谢：本研究得到德国洪堡基金会(Alexander von Humboldt Foundation)仪器设备捐赠基金(V?8151/02085)资助。
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